周儀 朝樂孟圖雅 刁辰 董愛榮 劉雪峰

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (鄂托克前旗森防站) (新賓縣林業(yè)局) (東北林業(yè)大學(xué))

樹錦雞子座叢赤殼菌(Stromatonectriacaraganae)是子囊菌門(Ascomycota)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、生赤殼科(Bionectriaceae)、子座叢赤殼屬(Stromatonectria)真菌。主要分布于維也納的豆科植物樹錦雞兒(Caraganasp.)、魚鰾槐(Coluteaarborescens)、金鏈花(Laburnumanagyroides)的樹枝上[1]。H?hnel在1905年根據(jù)維也納植物園收集的材料，最初將這種真菌命名為Myrmaeciellacaraganae。在他對M.caraganae的描述中，H?hnel認(rèn)識到M.caraganae沒有側(cè)絲[2]，但是在Myrmaeciella的關(guān)鍵詞中，他列出了側(cè)絲的存在是這個(gè)屬的一個(gè)重要的標(biāo)準(zhǔn)[3]。后來H?hnel發(fā)現(xiàn)Myrmaeciella中的M.moriformis是Nectriaparaguayensis的同物異名，并將該分類群和M.caraganae轉(zhuǎn)移到肉座菌科(Hypocreaceae)中的EndothiaFr.中[4-5]。同時(shí)他也將ValsonectriaSpeg.作為Endothia的同物異名[6]。1994年Samuels和Brayford[7]證實(shí)M.moriformis和N.paraguayensis是同物異名，這是在溫帶的南美洲發(fā)生在榆科(Ulmaceae)樸屬(Celtis)樹皮上的真菌，但是他們將其歸類為叢赤殼屬(Nectria)的1個(gè)種。至此M.caraganae的分類地位也變得模糊起來。2011年Jaklitsch et al.[1]重新描述了M.caraganae，并利用分子生物學(xué)技術(shù)闡明了其分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育的位置，將其歸類于生赤殼科的新屬——子座叢赤殼屬(Stromatonectria)，并將其命名為樹錦雞子座叢赤殼菌(S.caraganae)。筆者在研究樹錦雞兒病害標(biāo)本時(shí)，經(jīng)切片鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)該菌從形態(tài)學(xué)上與樹錦雞子座叢赤殼菌的無性型十分相似，隨后進(jìn)行分離純化，獲得該菌的純菌種，并進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，證明該菌為樹錦雞子座叢赤殼菌，在我國未見報(bào)道，為中國新紀(jì)錄種。

1 材料與方法

2016年12月，在東北林業(yè)大學(xué)校園采集到具有典型特征的樹錦雞兒枯死枝干標(biāo)本數(shù)枝，標(biāo)本號為Sc-1。

菌種分離：將所采集具有典型特征的枝干標(biāo)本用自來水沖洗干凈，然后將病部組織的子實(shí)體沿枝干切下，75%酒精表面消毒后，用刀片切成小薄片，置于滅菌后的離心管中，加入1 mL無菌水，振蕩數(shù)次后制成孢懸液。取一滴制備好的孢懸液于載玻片，并在顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)，將孢子濃度調(diào)節(jié)到4×10倍鏡下每視野40個(gè)孢子左右，取20 μL孢懸液，涂布在PDA平板上。之后置于培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)，約3 d萌發(fā)長出單菌落，于解刨鏡下挑取單菌落，純化培養(yǎng)后獲得純菌株S1，將S1分別接種在PDA培養(yǎng)基、添加20%樹錦雞兒樹皮煎汁的PDA培養(yǎng)基以及20%麥芽提取物培養(yǎng)基(MAE)上觀察其培養(yǎng)特性。菌種保存于PDA斜面培養(yǎng)基上。

形態(tài)學(xué)鑒定：借助手持放大鏡以及實(shí)體解剖鏡觀察病枝標(biāo)本Sc-1以及人工培養(yǎng)基上S1產(chǎn)生的子實(shí)體。同時(shí)徒手切片，用水作浮載劑制成臨時(shí)玻片標(biāo)本，然后在顯微鏡下觀察病原菌的分生孢子器、分生孢子、分生孢子梗的形態(tài)，拍攝照片，并測量其大小。

分子生物學(xué)鑒定：將S1菌株從PDA平板轉(zhuǎn)移到PD液體培養(yǎng)基中，黑暗條件下，25 ℃，160 r·min-1搖培7 d，經(jīng)無菌紗布過濾，獲得菌絲體。選取快捷型植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech (Beijing) Co.,LTD.)提取菌絲真菌基因組DNA。獲得DNA后使用核糖體ITS區(qū)段通用序列ITS1(5′-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCGCTTATT-GATATGC-3′)作為引物，對樣品的rDNA ITS1-ITS4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系，模板DNA 1.50 μL，引物各0.50 μL，dNTP 2.50 μL，10×Buffer 2.50 μL，Taq酶0.25 μL，滅菌ddH2O定容至25.00 μL。PCR反應(yīng)條件參數(shù)，預(yù)熱94 ℃、5 min，變性94 ℃、30 s，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，補(bǔ)平72 ℃、7 min；35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物委托上海生工測序公司進(jìn)行純化和測序。使用NCBI網(wǎng)站中的BLAST工具將測得的DNA序列進(jìn)行比對分析，根據(jù)比對結(jié)果，并與培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合確定該病原菌的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

Stromatonectriacaraganae(H?hn.) Jaklitsch & Voglmayr

≡MyrmaeciellacaraganaeH?hn.

≡Endothiacaraganae(H?hn.) H?hn.

該菌多寄生在老齡或枯死的樹錦雞兒枝條上，分生孢子器聚集或簇生。其無性階段產(chǎn)生的子座，初埋生于寄主皮下，肉眼可見樹皮下有小突起，后橫向開裂，突破樹皮，裂口處乳白色到淡黃色，光滑，裂口長1.7～3.0 mm。子座逐漸外露，裂口處向外凸起，每個(gè)子座上產(chǎn)生1至多個(gè)分生孢子器，顏色逐漸加深變?yōu)槌赛S色，半球形或不規(guī)則形，表面不均勻，子座大小(0.80～4.62)mm×(1.00～4.64)mm(圖1a)。分生孢子器多腔，不規(guī)則形(圖1c)，在潮濕的情況下通常融合大量分生孢子在孔口處形成孢子黏液(圖1b)。分生孢子梗透明至半透明，產(chǎn)生于單個(gè)圓柱形細(xì)胞或不規(guī)則膨脹的菌絲上，瓶梗輪生2～8或單側(cè)再分枝，?；ㄆ抗ｉL21.5～37.5 μm(n=30)，瓶梗(8.3～16.3)μm×(1.1～2.5)μm(n=50)(圖1d-e)。分生孢子單細(xì)胞，無色，透明，光滑，圓柱形或輕微彎曲，(3.1～5.4)μm×(0.8～1.5)μm(n=50)(圖1g)。

無性階段培養(yǎng)特性：分生孢子萌發(fā)慢，菌絲生長緩慢，在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)時(shí)，10 d在PDA培養(yǎng)基上直徑18～19 mm，菌落表面白色，背面淡黃色。與在添加20%樹錦雞兒樹皮煎汁的PDA培養(yǎng)基上生長速度相似，但在后者菌絲明顯更加致密。而在MAE培養(yǎng)基上，菌絲生長明顯變慢，10 d僅1～2 mm。暗培養(yǎng)30 d后取出見光，見光10 d后在菌落的中央及邊緣部分開始產(chǎn)生白色球狀的子座，表面密布白色絨毛樣菌絲，每個(gè)子座上產(chǎn)生1～3個(gè)半透明的孔口，隨著分生孢子器的成熟，顏色逐漸加深，成熟后變?yōu)槌赛S色，直徑0.60～1.68 mm(n=30)，個(gè)別直徑達(dá)到3.5 mm(圖1i)。另外，從菌絲的分支上也可以產(chǎn)生分生孢子，產(chǎn)孢細(xì)胞瓶梗形，(6.2～16.0)μm×(1.7～3.0)μm(n=30)。分生孢子頂生或側(cè)生，單細(xì)胞，無色，與自然寄主上產(chǎn)生的分生孢子形狀相同，(4.2～5.5)μm×(1.1～2.1)μm(n=50)(圖1f)。分生孢子24 h左右開始萌發(fā)，從兩頭分別長出芽管(圖1h)。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)序列分析，菌株S1的rDNA-ITS序列長616 bp。將所測rDNA-ITS序列在NCBI的BLAST上進(jìn)行比對，其中S1與GenBank中S.caraganae(Gen Bank ID:HQ112288，菌株號：CBS 125579)的相似度為99%。用菌株S1與BLAST結(jié)果中的近緣菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明S1與菌株S.caraganae在同一分支上，親緣關(guān)系最近，可信度為100(圖2)。

3 結(jié)論與討論

在國外樹錦雞叢赤殼菌在維也納的豆科植物樹錦雞、魚鰾槐、金鏈花的樹枝上被發(fā)現(xiàn)，而在中國僅在樹錦雞兒枝條上發(fā)現(xiàn)其無性階段。根據(jù)資料記載，該菌的無性型在自然寄主上產(chǎn)生的子座大小為0.3～0.9 mm，?；ㄐ∑抗?0～37 μm長，瓶梗(8.5～12.7)μm×(1.4～2.0)μm，分生孢子(4.0～5.5)μm×(1.2～1.5)μm。與標(biāo)本Sc-1稍有差異。同時(shí)資料記載其在人工培養(yǎng)基上瓶梗(8.0～13.5)μm×(2.0～2.5)μm，分生孢子(4.5～6.0)μm×(1.5～2.2)μm，在PDA培養(yǎng)基及MEA培養(yǎng)基上10 d的生長量分別為7～8 mm和3～5 mm，與筆者人工培養(yǎng)的測量數(shù)據(jù)也有一定差異。推測這些差異可能與其分布地區(qū)以及培養(yǎng)條件的差異有關(guān)，但依據(jù)其主要形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定確認(rèn)此菌為樹錦雞子座叢赤殼菌(Stromatonectriacaraganae)，在我國未見報(bào)道，為中國新紀(jì)錄種。

a、b.分生孢子器；c.分生孢子器切片；d、e.分生孢子器中產(chǎn)生的分生孢子梗(標(biāo)本Sc-1)；f.菌絲上產(chǎn)生的分生孢子梗；g.分生孢子；h.萌發(fā)的孢子；i.菌落形態(tài)特征(PDA培養(yǎng)基)。

圖1樹錦雞子座叢赤殼菌(S.caraganae)

圖2 S1菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中近緣菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

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[5] H?HNEL F V, AKAD K M K. Fragmente zur mykologie XIV. Mitteilung (No.719 bis 792)[J]. Sitzungsber Akad Wiss Wien, Mathem Naturwiss Kl, Abt I，1912,121:339-424.

[6] H?HNEL F V, AKAD K M K. Fragmente zur mykologie IX. Mitteilung (No.407 bis 467)[J]. Sitzungsber Akad Wiss Wien, Mathem Naturwiss Kl, Abt I，1909,118:1461-1552.

[7] SAMUELS G J, BRAYFORD D. Species ofNectria(sensu lato) with red perithecia and striate ascospores[J]. Sydowia,1994，46:75-161.