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大鼠因其成本低、腦內(nèi)血管解剖特性與人類相似等諸多特點，至今仍是研究腦缺血疾病最常用的動物。制作動物腦梗死模型的方法有很多種，其中大腦中動脈梗死(MCAO)線栓法模型因不開顱、易于操作而被廣泛應用。大鼠MCAO模型是目前公認的研究腦梗死、腦缺血的經(jīng)典模型，為研究腦缺血再灌注的機制及評估其治療方案的療效提供了可靠驗證平臺[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，短暫性腦缺血對神經(jīng)細胞起保護作用，可抵御其后發(fā)生的嚴重腦缺血，減輕缺血組織的病變程度，即誘發(fā)了腦缺血耐受(IT)[2]。腦缺血耐受是指給予短暫的亞致死性缺血后誘導的腦內(nèi)源性保護機制，從而對后續(xù)長時間缺血損傷產(chǎn)生耐受及自身保護作用。建立腦缺血耐受的模型為進一步研究腦缺血對腦梗死神經(jīng)保護作用的機制有重要意義。本研究旨在闡述在造模過程中的心得體會，并對造模過程中可能導致造模失敗的原因進行分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與器材 實驗動物：SPF級成年雄性SD大鼠60只，體重250 g～280 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。實驗器材：動脈夾，常規(guī)手術(shù)器械，顯微手術(shù)器械，碘伏，75%乙醇，眼科剪，生理鹽水，標志筆，3號、5號外科縫合絲線，10%水合氯醛，線身直徑0.26 mm，線頭直徑(0.36±0.02)mm，線長40 mm，頭端包被有多聚賴氨酸栓線(購自北京西濃科技有限公司，型號2636-100，A4級別)。

1.2 MCAO模型制作 大鼠適應性喂養(yǎng)2 d～3 d。采用線栓法經(jīng)左側(cè)頸內(nèi)動脈插入栓線制作大鼠MCAO模型。以10%水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔給藥麻醉后，固定于鼠板上，消毒頸前皮膚，參照文獻方法制作大鼠MCAO模型：備皮后沿頸部正中偏左側(cè)做切口，分離皮膚與淺筋膜，逐步暴露頸動脈鞘，鈍性分離頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)及頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)，結(jié)扎 ECA 及 CCA 近心端，在兩個結(jié)扎端之間的CCA剪一小口，將栓線經(jīng)CCA插向ICA，調(diào)整栓線走向，直至將栓線插入至規(guī)定部位。術(shù)后傷口消毒、皮膚縫合。

1.3 觀察指標 神經(jīng)功能缺損評分：造模后2 h進行神經(jīng)功能評分，采用Longa評分標準[3]，0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀，可正?；顒?；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈追尾；3分：行走時身體向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自主行走，意識喪失。0分和4分者剔除，1分～3分為造模成功。

1.4 實驗結(jié)果 造模時死亡15只，造模失敗10只，造模成功35只(12 h內(nèi)死亡4只、24 h后死亡5只，3 d后死亡4只，5 d時死亡4只)。

2 體 會

2.1 關(guān)于實驗動物的選擇 選用何種品系大鼠制作模型，取決于研究者的實驗條件和技術(shù)。目前經(jīng)典的動物是 Wistar 大鼠和 SD 大鼠。雌激素能擴張血管，增加腦血流量，減輕腦實質(zhì)損傷，具有明顯的神經(jīng)元保護作用[4]，可降低大鼠腦梗死的發(fā)生率和死亡率，因此，最好選擇雄性大鼠作為實驗對象，且以 250 g～280 g的雄性大鼠最佳。避免選用老齡大鼠，老齡大鼠腦動脈扭曲或管腔狹窄使線栓難以推進，且其抵抗力、耐受性均較差，選用壯年大鼠制備模型，成功率較高。

2.2 關(guān)于麻醉劑的選擇 國外研究者制備MCAO模型采用步驟繁瑣且價格昂貴的氟烷誘導麻醉。國內(nèi)學者多用2%戊巴比妥鈉(0.10 mL/100 g)或10%水合氯醛(0.30 mL/100 g)進行腹腔麻醉。對體重相同的大鼠進行麻醉，戊巴比妥鈉所用劑量較水合氯醛小，其麻醉劑量與致死量接近，易引起大鼠死亡；另外戊巴比妥鈉可使腦內(nèi)溫度下降明顯[3]，能夠減輕腦組織損傷，影響造模效果。故而選用10%水合氯醛作麻醉劑，其給藥濃度應控制在0.40 mL/100 g，濃度過高，容易麻醉過深，產(chǎn)生呼吸抑制，甚至死亡。

2.3 關(guān)于造模時手術(shù)操作 目前絕大多數(shù)研究者采用大鼠頸前正中切口。本實驗采用頸部外側(cè)切口[5]，方便鈍性分離肌肉，較好暴露手術(shù)視野，分離血管，同時避免對氣管造成機械刺激，減少對迷走神經(jīng)的刺激。結(jié)扎血管、動脈夾夾閉 ICA 時，需遠離頸動脈竇及迷走神經(jīng)節(jié)，防止大鼠猝死。在結(jié)扎準備完畢之后再用血管夾夾閉 ICA，縮短刺激血管及迷走神經(jīng)的時間。插線時保留適當長度線頭在血管外，用于充當牽引線，保證線栓進入血管后成功向顱內(nèi)推進，操作中適當調(diào)整血管及線栓進入角度，可提高插入成功率。

2.4 關(guān)于線栓選擇及插入深度 線栓制備方法直接關(guān)系到模型制備成功率。Longa等是將線栓頭端融成球形[6]，Koizumi等是在線栓頭端涂以硅樹脂，而Belayev等則是先加熱使線栓頭端變鈍，然后涂以多聚賴氨酸溶液。國內(nèi)研究者的處理方法也都不盡相同[7]。本實驗選用頭端包被有多聚賴氨酸栓線，以提高模型的穩(wěn)定性。體重與MCA的粗細在一定范圍內(nèi)存在正相關(guān)性，但大鼠體重超過400 g時，這種相關(guān)性明顯降低[8]。栓線過粗，易插破ICA或難以入顱；栓線過細，插入血管內(nèi)留有間隙不能完全阻塞血管，達不到梗死效果[9]。直徑大于0.3 mm的線栓在進入 ICA 和經(jīng) ICA入顱時易插破血管導致出血，導致造模失敗或動物死亡。而直徑為 0.28 mm時，模型制作成功率高、重復性好、對動物血管影響較小。因此對于體重 250 g～280 g 的大鼠，線栓的最佳直徑為 0.25 mm～0.28 mm。當栓線插入深度為1.0 cm～1.5 cm時，大鼠未出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損；栓線插入深度為1.8 cm～2.2 cm時，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，而插入深度超過2.2 cm時，大鼠極易昏迷不醒，造模后24 h內(nèi)死亡率高達37.33%。故而建議線栓插入深度以2.0 cm左右為最佳。

3 造模失敗原因分析

3.1 術(shù)中出血過多 造模過程中出血過多：包括分離頸部血管時出血、血管破裂出血、血管夾閉不全出血、線栓頭脫落出血、反復多次插入線栓出血等?？赡茉颍孩賹嶒炘炷r用眼科剪在 CCA剪開一斜形開口，在插入魚線時被剪開部分容易被拽斷，同時血管原有的生理形態(tài)扭曲改變，難以將線栓送入顱內(nèi)，即便勉強將線栓送入，也因血管斷開、出血過多，不能保證線栓插入的深度，導致造模成功率下降，死亡率增高。②不熟悉大鼠解剖結(jié)構(gòu)，造模時間較長，線栓插入不順，反復推送不能進入規(guī)定位置，使得血管塌陷，難以區(qū)分頸動脈鞘及血管，線栓多次刺激血管壁，甚至刺穿血管壁，致使造模過程中出血量增多，引起大鼠死亡。

3.2 術(shù)前及術(shù)中、術(shù)后可能存在的原因 ①造模前24 h未予禁食，大鼠體內(nèi)過高的血糖水平可能增加術(shù)后腦梗死面積[10]；進食影響體重使得水合氯醛給藥總量過多造成死亡。②水合氯醛配制時間太久，沒有進行避光保存，使得給藥劑量偏差加大。水合氯醛不穩(wěn)定，久置、光照、高溫等條件均可促進其分解，用其進行腹腔麻醉，需現(xiàn)配現(xiàn)用，否則給藥劑量過大引起大鼠麻醉過深，呼吸道分泌物增多，若合并分離血管時損傷迷走神經(jīng)，則更易導致大鼠窒息死亡，所以術(shù)中必須精確麻醉，小心操作。③動物蘇醒后出現(xiàn)狀態(tài)不佳，不欲進食、進水、甚至出現(xiàn)腹瀉、精神萎靡等癥狀，造模后24 h內(nèi)死亡率極高，原因可能是水合氯醛麻醉過量，對胃腸道造成一定影響，加之腹瀉脫水、術(shù)中失血過多，導致低血容量休克死亡。④腹腔麻醉時麻醉藥注射入腸腔造成麻醉不足及術(shù)后腸梗阻。腹腔注射時注意將針頭向外回抽。⑤造模、麻醉期間、造模后沒有注意保溫，導致低體溫及亞低溫損傷增加了大鼠死亡率[11]。⑥手術(shù)時間過長，手術(shù)部位大量體液不顯性揮發(fā)、術(shù)中失血，術(shù)后未予以及時補液，導致體液丟失嚴重，影響造模成功。⑦手術(shù)過程中沒有嚴格執(zhí)行無菌操作，術(shù)前、術(shù)后預防感染不及時。應在術(shù)后手術(shù)縫合部位撒少量青霉素粉劑，也可術(shù)前予以腹腔注射青霉素G 20×104U～30×104U(溶于1 mL～2 mL生理鹽水中)預防感染。

3.3 其他可能原因 ①術(shù)中血栓形成：線栓插入損傷血管內(nèi)皮，可能導致血栓形成，堵塞重要血管，阻礙線栓插入，栓線方向應盡量與血管走行方向保持一致；②線栓頭端不平整光滑、插線用力過猛或反復多次調(diào)整栓線角度，使得線栓進入蛛網(wǎng)膜，形成蛛網(wǎng)膜下隙出血；③造模時間過長，使得線栓在阻斷MCA時，同時影響下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞循環(huán)，導致腦缺血后高溫，影響造模結(jié)果的可靠性。

4 結(jié) 語

MCAO模型是研究腦梗死疾病的基礎(chǔ)[1，12]，雖然其造模方法仍在不斷的改進，但線栓法制備MCAO模型以其可重復性強、造模成功率高等優(yōu)點，仍為多數(shù)研究者首選的經(jīng)典造模方法。線栓法制備MCAO模型的環(huán)節(jié)眾多，故而影響造模成功的因素頗多，每一步都應重視。造模前需考慮存在的各種干擾因素，積極尋找應對措施，提高造模成功率，盡可能制備出最大程度接近于人類腦梗死的MCAO模型，為研究人類腦梗死的發(fā)病機制和驗證臨床治療手段發(fā)揮更大的作用?？傊?，在制備大鼠MCAO模型過程中，處理好實驗動物的選擇，線栓的制備，線栓插入深度和插入方法，麻醉劑的選擇，手術(shù)操作手法，術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后合理干預等步驟，保證并提高模型的成功率，使實驗差異性進一步減小。另外，線栓法制備MCAO模型還存在許多不足，需不斷改進完善，實驗中可以不斷地解決問題、摸索創(chuàng)新，確保模型的成功。

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