梁艷瓊 ，吳偉懷 ，2，黃興 ，習(xí)金根 ，李銳 ，鄭金龍 ，賀春萍 *，易克賢 *

（1．中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶農(nóng)林有害生物入侵檢測與控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物檢測監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?71101；2．農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部儋州熱帶作物科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，海南儋州571737）

甘蔗是我國最主要的糖料作物，種植面積和產(chǎn)糖量均占全國的90%以上[1]。近幾年來，隨著現(xiàn)代甘蔗產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，在過度追求高產(chǎn)與經(jīng)濟(jì)效益的發(fā)展模式下以及國外品種引進(jìn)、各蔗區(qū)間相互頻繁調(diào)種，為甘蔗重要病害的擴(kuò)散提供了條件，再加上甘蔗種植區(qū)生態(tài)的多樣性和復(fù)雜性，甘蔗病害種類和類型逐年增加，而且病害程度也逐年擴(kuò)大，在種植過程中甘蔗病害因防治不力導(dǎo)致影響范圍逐漸擴(kuò)大，給我國的甘蔗安全生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重隱患[2-6]。目前世界上已知的甘蔗病害已達(dá)160余種，我國發(fā)現(xiàn)的有60多種，其中大陸蔗區(qū)發(fā)生的約50種[7]。甘蔗病害是造成甘蔗減產(chǎn)的主要因素，抗病品種選育和化學(xué)防治是目前防治甘蔗病害的主要措施，然而抗病品種選育不僅周期長，而且易因病原致病性的分化而喪失抗性，長期施用化學(xué)農(nóng)藥，不僅造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留，而且易使病原菌產(chǎn)生耐藥性[8]，因此亟待尋求一種更持久、更安全的防治措施。

近年來，隨著生防農(nóng)藥的推廣使用，人們逐漸認(rèn)識到生物防治的巨大發(fā)展前景，因而植物的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性作為一種重要的生防措施也日益受到國內(nèi)外的重視[9-10]。誘導(dǎo)寄主細(xì)胞改變物理結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生生理生化反應(yīng)是植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的兩個(gè)主要機(jī)制，其中生理生化反應(yīng)變化主要是通過影響植物抗病相關(guān)防御酶的催化活動來實(shí)現(xiàn)的，主要包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）等防御酶[11]。目前已有大量研究報(bào)道生防微生物能夠誘導(dǎo)這些植物抗病相關(guān)防御酶發(fā)生變化，從而增強(qiáng)植物抗病能力[12]，因此，有關(guān)解淀粉芽孢桿菌誘導(dǎo)植物抗病性已成為了研究熱點(diǎn)。王璐瑤等報(bào)道了解淀粉芽胞桿菌B1619灌根處理后番茄葉片POD、SOD和PAL活性比未處理的顯著提高；MDA含量比未處理的顯著降低[13]。谷醫(yī)林等用解淀粉芽胞桿菌LJ1發(fā)酵上清100倍稀釋液噴施黃瓜幼苗，測定黃瓜葉片中SOD、PPO、PAL三種酶的活性在不同時(shí)間點(diǎn)均有一個(gè)驟增的過程，其活性顯著高于對照[14]。本實(shí)驗(yàn)室前期在臺灣草上分離獲得一株廣譜抗性的解淀粉芽孢桿菌TWC2，以甘蔗葉片中與抗病相關(guān)防御酶類SOD、CAT、PAL、POD和PPO及MDA的含量為指標(biāo)，通過TWC2菌株發(fā)酵液噴施處理甘蔗植株，測定甘蔗葉片中SOD、CAT、PAL、POD和PPO以及MDA含量的變化情況，明確TWC2菌株誘導(dǎo)甘蔗植株抗病性的能力，為進(jìn)一步深入研究TWC2菌株的生防作用機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

生防菌解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）TWC2，分離自熱帶牧草臺灣草植株葉片，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。甘蔗品種采用桂蔗24號，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 TWC2發(fā)酵液制備 將解淀粉芽孢桿菌TWC2菌株在 LB培養(yǎng)基（蛋白胨 10g，酵母浸出粉 5g，氯化鈉10g，瓊脂粉15～20g，蒸餾水1000 mL，pH自然）平板中活化，34℃恒溫培養(yǎng) 24 h得到活化的TWC2菌株單菌落，然后挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，于34℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)16 h即得TWC2種子液。按5%的接種量將TWC2種子液接入LB培養(yǎng)基中，34℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)48 h獲得TWC2發(fā)酵液?；罹?jì)數(shù)后用無菌水稀釋至108CFU/mL的菌懸液備用。以108CFU/mL菌懸液為1倍原液，用無菌水調(diào)節(jié)菌液濃度，稀釋獲得10倍稀釋液及100倍稀釋液。

1.2.2 TWC2發(fā)酵液誘導(dǎo)處理 待甘蔗苗長至30 cm左右時(shí)，選取長勢一致的健康植株布置盆栽試驗(yàn)。設(shè)置4個(gè)處理，處理1為1倍原液，處理2為10倍稀釋液，處理3為100倍稀釋液，處理4以噴灑等量LB液體培養(yǎng)基為對照。分別取50 mL上述不同處理的培養(yǎng)液均勻噴灑植株葉面，每處理20株。

1.2.3 甘蔗植株抗病相關(guān)防御酶活性測定 各處理組分別于噴灑后第24、48、72、96和120 h隨機(jī)選取5株甘蔗苗，采集每株植株的頂端葉片1g，加入提取液在冰上研磨至勻漿，提取粗酶液，取上清液用于CAT、SOD、POD、PAL和PPO酶活測定。各物質(zhì)測定分別采用CAT試劑盒（CAT-1-Y）、SOD試劑盒（SOD-1-Y）、POD試劑盒（POD-1-Y）、PAL試劑盒（PAL-1-Y）、PPO試劑盒（PPO-1-Y）。試劑盒均由蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供，測定方法根據(jù)各試劑盒使用說明進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Excel 2007作圖，采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TWC2發(fā)酵液處理后甘蔗葉片CAT活性變化

由圖1可知，經(jīng)TWC2噴灑處理后，各濃度處理組的CAT活性均高于對照組，其中10倍和1倍稀釋液處理組活性均表現(xiàn)為隨時(shí)間的增加先升高直至峰值后逐漸降低，且CAT酶活性分別在48和72 h達(dá)到峰值，此時(shí)酶活差異最大，與對照處理組差異最顯著（P＜0．01）；而100倍稀釋液處理組CAT酶活略高于對照，但差異不顯著（P＞0．05），且其酶活隨時(shí)間的增加呈平穩(wěn)的趨勢。

2.2 TWC2發(fā)酵液處理后甘蔗葉片PAL活性變化

由圖2可知，PAL活性測定結(jié)果表明，10倍稀釋液處理組PAL活性呈先上升后下降的趨勢，并在第72h時(shí)達(dá)到峰值，是對照組的2．24倍；1倍稀釋液處理組PAL活性在48 h出現(xiàn)短暫降低后持續(xù)增高，在第96h時(shí)達(dá)到峰值184．59 U/g，與對照組差異達(dá)到顯著；100倍稀釋液處理組與對照組的PAL活性在各時(shí)間點(diǎn)均無顯著性差異，也沒有出現(xiàn)明顯峰值，可能是菌液濃度太低。

2.3 TWC2發(fā)酵液處理后甘蔗葉片POD活性變化

由圖3可知，經(jīng)TWC2發(fā)酵液處理后，10倍稀釋液處理組的POD在0～72h呈急速增長的趨勢，在72h時(shí)達(dá)到峰值26746．38 U/g，與對照組活性差異達(dá)到極顯著水平；1倍稀釋液和100倍稀釋液處理組POD活性先緩慢上升，在96h時(shí)達(dá)到峰值后緩慢下降，峰值分別為15715．63 U/g和 10414．18U/g，是對照組的 3．61和 2．20倍，與對照組的差異分別達(dá)到極顯著和顯著水平。

2.4 TWC2發(fā)酵液處理后甘蔗葉片SOD活性變化

SOD活性測定結(jié)果（圖4）表明，經(jīng)TWC2發(fā)酵液誘導(dǎo)后的3個(gè)處理組SOD活性均呈現(xiàn)先急劇增長后下降的趨勢，活性變化明顯，且在誘導(dǎo)后第48h到達(dá)峰值，其中1倍和10倍稀釋液兩個(gè)處理組 SOD活性分別達(dá)到 1402．86和1244．53 U/g，是對照組的 5．42 和 4．81 倍，與對照組差異達(dá)極顯著水平；100倍稀釋液處理組的酶活是對照組的2．33倍，峰值為604．70 U/g，對照組的酶活變化不大，與其他3組處理SOD酶活差異顯著。

2.5 TWC2發(fā)酵液處理后甘蔗葉片PPO活性變化

PPO活性測定結(jié)果（圖5）表明，經(jīng)TWC2發(fā)酵液噴灑誘導(dǎo)后的處理組PPO活性均表現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，對照組的PPO活性基本無明顯變化。經(jīng)TWC2發(fā)酵液誘導(dǎo)處理后，10倍稀釋液處理組PPO活性在第48 h達(dá)到最高值63．71 U/g，是對照組的2．46倍，與對照差異極顯著，誘導(dǎo)效果最好；1倍稀釋液處理組的PPO活性峰值在第48h出現(xiàn)，是對照組的1．59倍，與對照組差異顯著，但在隨后的時(shí)間內(nèi)無明顯變化；100倍稀釋液處理組的PPO活性在第48 h達(dá)到峰值，而后緩慢降低至與對照接近的水平，與對照差異不顯著。

2.6 TWC2發(fā)酵液處理后對甘蔗葉片MDA含量的影響

由圖6可知，對照組的MDA含量比較穩(wěn)定，無明顯變化。與對照處理組相比，10倍稀釋液處理組MDA含量在24～48h時(shí)下降，比對照組降低了43．12%，之后MDA含量呈上升-下降趨勢，在72h達(dá)到峰值。1倍稀釋液和100倍稀釋液處理組的MDA含量呈先上升后降低的趨勢，并在72h時(shí)達(dá)到峰值，MDA含量分別為10．13μmoL/g 和 11．64μmoL/g。

3 討論

誘導(dǎo)植物抗病性包括系統(tǒng)獲得抗病性和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性。由生物防治拮抗菌所引起的植物系統(tǒng)抗病性屬于誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性。寄主防御酶系、病程相關(guān)蛋白（PR-蛋白）、活性氧現(xiàn)象及木質(zhì)素的積累是誘導(dǎo)抗性的重要表征[15]。SOD和POD是植物體內(nèi)清除活性氧毒性的保護(hù)酶，POD還能催化酚類物質(zhì)合成木質(zhì)素，使受侵染組織的木質(zhì)化程度加深，SOD、POD活性的高低與植物抗逆性密切相關(guān)[16]。PAL是苯丙烷類代謝途徑的限速酶與關(guān)鍵酶，其參與代謝途徑合成的中間產(chǎn)物（如酚類物質(zhì)、木質(zhì)素等）是植物體內(nèi)重要的抗菌物質(zhì)[15，17]。CAT作為重要的內(nèi)源活性氧清除劑，可以清除體內(nèi)的過氧化氫，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一[18]。喬俊卿等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌菌株P(guān)TS-394灌根番茄后，番茄葉片中PAL、POX、LOX和PPO的活性均有不同程度的持續(xù)增加，誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，從而提高其對番茄灰霉病的抗性[19]。陳劉軍等研究發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)芽孢桿菌AR156誘導(dǎo)水稻植株提高了PAL、SOD、CAT和POD等防御酶活性，從而提高水稻對紋枯病的抗性[20]。由此可知，生防菌對植物抗病相關(guān)防御酶的誘導(dǎo)是生防微生物防治植物病害發(fā)生的重要機(jī)制之一。本研究通過測定施用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液后甘蔗葉片不同生長時(shí)期與誘導(dǎo)植物抗病性密切相關(guān)的植株酶活力（PAL、POD、SOD、PPO、CAT）變化的結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌TWC2發(fā)酵液處理后甘蔗葉片幾種防御酶活力均有所上升，這個(gè)結(jié)果說明TWC2一定程度上誘導(dǎo)了甘蔗體內(nèi)抗性酶活性的增高，使甘蔗植株產(chǎn)生了更高的抗病酶活力，增強(qiáng)了植物的抗病能力，進(jìn)一步說明了其作為生物農(nóng)藥的良好應(yīng)用前景。

本研究中經(jīng)解淀粉芽孢桿菌TWC2發(fā)酵液10倍稀釋液處理甘蔗葉片，葉片中抗病相關(guān)酶系（PAL、SOD、POD、PPO）顯著高于其他濃度處理，與唐文等[18]、傅瑩等[21]的研究結(jié)果相符，表明提高發(fā)酵液濃度并不一定能誘導(dǎo)植株防御酶活性升高，拮抗菌發(fā)酵液濃度與誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的效果并非呈正相關(guān)。

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化分解的主要產(chǎn)物，其含量的高低反映了植物細(xì)胞膜受損害程度以及植物耐受逆境條件的能力，MDA的大量累積可影響電解質(zhì)外滲，嚴(yán)重時(shí)甚至可使細(xì)胞死亡[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，施用TWC2發(fā)酵液后，其體內(nèi)的抗病相關(guān)防御酶水平會顯著提高，而MDA含量變化呈平穩(wěn)趨勢，與對照組相比，處理組的MDA含量均顯著降低，證明TWC2菌株可有效抑制因病原菌作用引起的MDA含量升高，降低甘蔗植株受損害的程度，提高植株的抗病性。