鄒奕 ，馬龍彪 ，2，3，江偉 ，李文晶 ，吳則東 ，2，3*

（1．黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；2．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱 150080；3．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080）

甜菜是許多國(guó)家的重要經(jīng)濟(jì)作物，其商業(yè)栽培已延伸至世界上50多個(gè)國(guó)家。栽培甜菜分為食用甜菜、飼用甜菜、葉用甜菜和糖用甜菜，目前在我國(guó)種植面積最大的是糖用甜菜，2014—2016年每年的播種面積13．5萬(wàn)公頃～14．9萬(wàn)公頃（據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)年鑒網(wǎng)）。糖用甜菜是世界上主要的糖料作物，甜菜糖大約占到世界食糖總量的25%。目前我國(guó)甜菜發(fā)展主要面臨幾個(gè)困境，一是隨著國(guó)產(chǎn)新品種的不斷增加和外來(lái)品種的引進(jìn)，品種鑒定難度逐漸增大，僅根據(jù)表型特征區(qū)分品種是困難的，因此建立一套快速鑒定甜菜品種的檢測(cè)方法至關(guān)重要，而通過(guò)DNA分子鑒定方法檢測(cè)品種，將節(jié)省大量的時(shí)間[1]；二是甜菜病害較為嚴(yán)重，常見(jiàn)的甜菜病害包括褐斑病、根腐病、叢根病等，病害的防治主要是依靠化學(xué)藥劑，容易引起農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生抗藥性，因此，抗病品種的篩選尤為重要；三是國(guó)外進(jìn)口甜菜品種基本占據(jù)了我國(guó)甜菜種子市場(chǎng)的95%以上，亟需優(yōu)質(zhì)國(guó)產(chǎn)種子補(bǔ)充市場(chǎng)。

區(qū)間簡(jiǎn)單重復(fù)（Inter-simple sequence repeat，ISSR）標(biāo)記技術(shù)是基于PCR的一種分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)通常利用長(zhǎng)16～25bp的微衛(wèi)星作為引物，在單引物PCR反應(yīng)中靶向多個(gè)基因座，主要擴(kuò)增不同大小的SSR間序列。所使用的引物可以是未錨定的、或者通常在3′或5′端錨定1至4個(gè)簡(jiǎn)并堿基延伸到堿基序列。ISSR技術(shù)將AFLP和微衛(wèi)星分析的大部分優(yōu)點(diǎn)與RAPD的普遍性相結(jié)合。ISSR具有很高的重復(fù)性，可能是由于使用了較長(zhǎng)的引物（16～25 mers），與 RAPD 引物（10-mers）相比，可以使用高退火溫度（45～60℃），從而具有更高的嚴(yán)格性。研究表明，只有最微弱的譜帶是不可重現(xiàn)的[2]。當(dāng)使用聚丙烯酰胺檢測(cè)時(shí)，92%～95%的片段可以在相同栽培品種的DNA樣品上重復(fù)[3]。ISSR分子標(biāo)記自建立以來(lái)就已被廣泛用于植物遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構(gòu)建或品種鑒定等[4]，并在甜菜分子育種上得到了較為廣泛的應(yīng)用。本文將就ISSR分子標(biāo)記在甜菜育種上的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在甜菜上的未來(lái)發(fā)展進(jìn)行展望。

1 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在甜菜育種中的應(yīng)用

1.1 甜菜的抗病育種

吳旭紅[5]使用ISSR分子標(biāo)記，對(duì)甜菜高抗品種ZD204及其雜種后代的抗病基因進(jìn)行標(biāo)記，以達(dá)到使用分子標(biāo)記來(lái)輔助抗病育種的早期鑒定并選擇雜種的目的。對(duì)KWS9419株系和ZD204的雜交后代采用BSA法和RAPD分析，獲得了和甜菜抗根腐病基因連鎖的RAPD標(biāo)記0PP084760，然后將其轉(zhuǎn)變?yōu)镮SSR標(biāo)記，可以對(duì)甜菜雜種的幼苗期抗根腐病基因進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定。吳旭紅[6]還應(yīng)用ISSR技術(shù)，用80個(gè)ISSR引物對(duì)兩親本甜菜基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，77．5%的擴(kuò)增條帶清晰，其中42條在親本間表現(xiàn)出多態(tài)性條帶。引物BA0061在ZD204中擴(kuò)增出1200bp的多態(tài)性條帶，證明了3個(gè)不同遺傳背景的甜菜品種（系）中可以擴(kuò)增出標(biāo)記BA0061-1200，已知含有該抗性基因1200bp條帶，而其他3條不含有這個(gè)抗性基因沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物。這表明標(biāo)記BA0061-1200更具有特異性，在檢測(cè)抗性基因方面具有很大的潛力。利用ISSR標(biāo)記分析F2群體的抗病性，表現(xiàn)了ISSR標(biāo)記的可行性和優(yōu)越性。

1.2 開(kāi)發(fā)SSR引物

牛澤如等[7]使用ISSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)了甜菜SSR引物。試驗(yàn)設(shè)計(jì)思路是以AFLP-PCR和ISSR-PCR為基礎(chǔ)，結(jié)合基因組步移，構(gòu)建基因組文庫(kù)，然后擴(kuò)增兩個(gè)微衛(wèi)星之間的序列進(jìn)行基因組步移，獲得另一端微衛(wèi)星序列。ISSR-PCR定位于SSR區(qū)域，并對(duì)含有SSR序列的片段進(jìn)行進(jìn)一步靶向選擇，起到了富集微衛(wèi)星片段的作用，這種方法不使用放射性探針標(biāo)記和繁瑣的雜交，便捷安全，微衛(wèi)星獲得率較高。因?yàn)镮SSR引物具有通用性，并且有很多不同限制性內(nèi)切酶可供使用，只要可以設(shè)計(jì)合適的PCR引物并得到滿足SSR引物設(shè)計(jì)的片段，就可以得到想要的SSR引物。

1.3 甜菜種質(zhì)資源和品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建

劉華君等[8]對(duì)18份來(lái)自德國(guó)的甜菜品種和2份來(lái)自瑞士的甜菜品種進(jìn)行遺傳圖譜的構(gòu)建和聚類分析，從100個(gè)ISSR引物中篩選出了7個(gè)具有良好多態(tài)性的ISSR引物，使用7個(gè)ISSR引物擴(kuò)增了20個(gè)甜菜種質(zhì)資源，共得到了39個(gè)等位變異，每個(gè)引物檢測(cè)到3～8個(gè)等位變異，平均等位變異為5．6個(gè)，其中30條多態(tài)性條帶，7 套 ISSR 引物的多態(tài)信息含量（PIC）為 0．6273～0．8360，平均數(shù) 0．7650，20 個(gè)供試品種的遺傳相似系數(shù)為0．4615～0．9231，平均數(shù)0．6923。傅增娟[9]首先對(duì)甜菜ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，確定了合適的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定了33個(gè)甜菜種質(zhì)資源，僅利用1條引物就鑒別了10份甜菜種質(zhì)資源。劉巧紅等[10]利用兩條ISSR引物就成功地鑒定了10個(gè)不同來(lái)源的甜菜品種，遺傳相似系數(shù)為0．43～0．83，平均為 0．62。 Izzatullayeva等人[11-12]利用 ISSR 和 RAPD 對(duì)甜菜品種的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中12條ISSR引物共產(chǎn)生178個(gè)條帶，其中173條為多態(tài)性條帶，發(fā)現(xiàn)ISSR引物更加適合甜菜的遺傳多樣性分析。Srivastava等人[13]利用同工酶、RAPD和ISSR共同對(duì)甜菜品種進(jìn)行遺傳多樣性分析。表明ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以有效地進(jìn)行甜菜品種和資源的指紋圖譜構(gòu)建以及遺傳多樣性分析。 Amini等人[14]利用ISSR標(biāo)記分析伊朗甜菜引起根腐病的腐霉菌的遺傳多樣性，從伊朗8個(gè)省搜集到的19個(gè)腐霉菌的分離純化物，利用8個(gè)ISSR引物進(jìn)行分析，結(jié)果表明，8個(gè)省的腐霉菌之間均有親緣關(guān)系，親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近和地理分布沒(méi)有必然的聯(lián)系。

1.4 ISSR分子標(biāo)記在甜菜其它方面的應(yīng)用

Kiyoshi[15]等人分別從甜菜葉片、根以及葉柄中提取立枯絲核菌，利用后代的體細(xì)胞親和性分組研究了田間分離株的遺傳變異，體細(xì)胞相容性群體的數(shù)量與獲得親本分離株的宿主植物組織密切相關(guān)，來(lái)自根和葉柄的分離物往往是遺傳異質(zhì)性的，并且產(chǎn)生多個(gè)體細(xì)胞親和組，而來(lái)自葉的分離物傾向于是均質(zhì)的，并且產(chǎn)生單一的體細(xì)胞親和組，這些發(fā)現(xiàn)得到了ISSR分析結(jié)果的支持，表明均質(zhì)分離物產(chǎn)生了具有相同基因型的后代，而異源分離物產(chǎn)生了具有不同基因型的后代。Fayed等人[1]分別利用3個(gè)不同耐蟲基因型的甜菜，采用同工酶技術(shù)和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，找到了與耐蟲相關(guān)聯(lián)的ISSR標(biāo)記。Sen等人[16]利用ISSR標(biāo)記分析用γ射線輻射誘導(dǎo)的耐旱甜菜突變體，在對(duì)照和耐旱突變體中檢測(cè)到多態(tài)性，利用19條ISSR引物，共擴(kuò)增出106個(gè)PCR片段，其中91個(gè)為多態(tài)性片段。劉乃新等[17]篩選出了5條ISSR引物，建立了甜菜老化處理后ISSR特異性譜帶。劉乃新等人[18]還對(duì)甜菜ISSR引物擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法進(jìn)行了研究，分別對(duì)使用6%的聚丙烯酰胺凝膠以及2%的瓊脂糖檢測(cè)的使用范圍進(jìn)行了分析，指出對(duì)于指紋圖譜的構(gòu)建以及遺傳多樣性的分析等適宜于用6%的聚丙烯酰胺凝膠，而品種純度檢測(cè)則需要使用2%的瓊脂糖凝膠。

2 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在甜菜育種中應(yīng)用的前景與展望

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有容易操作、可靠性高、重復(fù)性強(qiáng)、多態(tài)性好等優(yōu)點(diǎn)，已趨于成熟。ISSR已被成功地應(yīng)用于估計(jì)多種作物品種如水稻[19]、小麥[20]、穇子[21]、豇豆[22]、甘薯[23]和車前草[24]的遺傳多樣性分析；在一項(xiàng)關(guān)于白羽扇豆的研究中，已經(jīng)證明在10個(gè)引物中，任何兩個(gè)都足以區(qū)分所研究的37份材料[25]；同樣，4個(gè)引物足以區(qū)分34個(gè)品種的馬鈴薯[26]，3個(gè)引物能夠區(qū)分16個(gè)紅漿果基因型[27]，使用這種高信息量的引物降低了多樣性分析的成本、時(shí)間和勞動(dòng)力。盡管ISSR標(biāo)記具有較高的效率和可重復(fù)性，但尚未廣泛使用，然而，在解決亞洲栽培稻[19]、小麥[20]、穇子[21]、豇豆[22]和二行芥物種[28]的系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的問(wèn)題方面已被發(fā)現(xiàn)是有效的；另外ISSR分子標(biāo)記還廣泛應(yīng)用到遺傳圖譜的構(gòu)建上，如在日本和歐洲落葉松基因組的圖譜中，ISSR也與AFLP和RAPD標(biāo)記一起使用[29]。柑橘的遺傳連鎖圖譜使用75個(gè)ISSR標(biāo)記，分布在所有連鎖群中[30]。與重要的農(nóng)藝性狀密切相關(guān)的DNA標(biāo)記極大地促進(jìn)了作物改良計(jì)劃。在水稻中，將由引物（AG）8YC產(chǎn)生的ISSR標(biāo)記轉(zhuǎn)化為序列標(biāo)簽位點(diǎn)（STS）標(biāo)記以鑒定育性恢復(fù)基因Rf-1[31]。在鷹嘴豆中，由引物（AG）8YT和UBC 8251200引物（AG）8T產(chǎn)生的ISSR標(biāo)記UBC 855500與賦予對(duì)枯萎病的種族4抗性的基因[32]連接。

目前ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在甜菜上的應(yīng)用還比較少，未來(lái)應(yīng)積極地拓寬該技術(shù)在甜菜遺傳育種研究上應(yīng)用的深度，特別是在甜菜遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定、品種鑒定以及抗性育種等方面，積極借鑒在其他作物上成功應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)，可有效縮短育種年限、提高育種效率，推動(dòng)甜菜遺傳育種的研究發(fā)展，促進(jìn)甜菜品種的育成和更新?lián)Q代。