劉言振，趙婷婷，李佳霖，林 雨，李 平?

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所 免疫炎性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029）

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是多種病因?qū)е碌穆阅I臟病進(jìn)展至終末期腎病的共同途徑。抑制RIF 被認(rèn)為是保護(hù)腎臟的有效治療策略。單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）模型是研究慢性腎臟病的一種常見模型，高度契合人類腎臟疾病過程，在相對(duì)較短的時(shí)間跨度內(nèi)，基本上概括了典型的纖維化形成反應(yīng)的關(guān)鍵特征。并且UUO 模型便于制作，成為眾多學(xué)者研究腎間質(zhì)纖維化常選用的動(dòng)物模型。中藥在防治腎間質(zhì)纖維化方面有著其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。因此，本文將介紹近年來在UUO 模型上中藥治療腎間質(zhì)纖維化的研究進(jìn)展。

1 UUO 引起腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制

腎間質(zhì)纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)的過度積聚。在輸尿管梗阻模型中導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化主要是由這樣三個(gè)病理過程：炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及大量細(xì)胞因子釋放，成纖維細(xì)胞活化和增生，細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生增多和降解減少。另外腎小管萎縮，微血管減少和組織缺氧，也都促進(jìn)了腎間質(zhì)纖維化的形成。以下將分別討論在UUO 以上的幾個(gè)病理過程中起到主要作用的細(xì)胞和細(xì)胞因子。

1.1 炎細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞因子增多

阻塞后靜水壓力增加導(dǎo)致腎小管膨脹，腎血流量顯著減少和腎小球?yàn)V過率明顯降低。腎小管上皮細(xì)胞（tubular epithelial cells，TEC）以及腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞因機(jī)械牽張，局部缺血，或有害因子的刺激損傷后，分泌細(xì)胞因子、趨化因子等細(xì)胞因子，使炎細(xì)胞聚集在腎小管間質(zhì)周圍，聚集的炎癥細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)以及致纖維化因子又進(jìn)一步加重腎臟的損傷。UUO 模型建立的數(shù)小時(shí)后粘附因子和趨化因子的分泌增加，并持續(xù)7～10d。

1.1.1 單核巨噬細(xì)胞

巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)于腎間質(zhì)的主要炎性細(xì)胞。在UUO 早期，TEC 表達(dá)的巨噬細(xì)胞集落刺激因子和單核細(xì)胞趨化蛋白-1 促使了單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。模型建立的12h 后腎間質(zhì)浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞進(jìn)行性增加，通過合成和分泌促增殖因子和血小板衍生生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素-1 等細(xì)胞因子直接促進(jìn)固有的成纖維細(xì)胞增殖活化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成增多，腎間質(zhì)單核巨噬細(xì)胞的聚集與纖維化程度高度相關(guān)。

1.1.2 肥大細(xì)胞

正常腎臟幾乎沒有肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，在病變的腎臟中肥大細(xì)胞的數(shù)量與纖維化程度呈正相關(guān)，肥大細(xì)胞是嚙齒動(dòng)物UUO 模型中發(fā)生腎纖維化所必需的。在UUO 腎中發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞緊鄰肥大細(xì)胞，表達(dá)血管緊張素ⅡAT1 受體和組胺H1R 亞型。Veerappan 等的研究結(jié)果表明，肥大細(xì)胞介質(zhì)如血管緊張素Ⅱ和組胺的釋放介導(dǎo)了一種將肥大細(xì)胞脫顆粒與成纖維細(xì)胞活化與隨后的纖維化相結(jié)合的機(jī)制[1]。靶向肥大細(xì)胞及其產(chǎn)物可能成為預(yù)防腎纖維化的新型治療靶點(diǎn)。另外，中性粒細(xì)胞和T 細(xì)胞在梗阻24h后出現(xiàn)增加，一直持續(xù)至第14d。

1.1.3 血管緊張素Ⅱ

血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）在UUO 病變的腎間質(zhì)中濃度高達(dá)血漿中的幾十倍。Ang Ⅱ能直接刺激成纖維細(xì)胞的激活和轉(zhuǎn)分化形成肌成纖維細(xì)胞，并且促進(jìn)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激加重纖維化[2]。AngⅡ的促生長(zhǎng)效應(yīng)可以通過促進(jìn)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表達(dá)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），骨橋蛋白，和核因子-β 等的表達(dá)促進(jìn)纖維化。血管緊張素也可通過影響腎小球血流動(dòng)力和水電解質(zhì)平衡造成腎損傷?？梢酝ㄟ^受體拮抗劑的使用來減輕。在UUO 模型中使用AT1 受體拮抗劑（如氯沙坦）或AT2 受體拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑均可防止炎癥反應(yīng)和腎纖維化的形成[3]。

1.1.4 TGF-β1

TGF-β1 是最初從血小板分離的多功能細(xì)胞因子，在它的幾種異構(gòu)體中TGF-β1 被認(rèn)為是UUO 模型中引起腎纖維化的最主要因子，它的上調(diào)與腎纖維化程度成正相關(guān)。其主要通過以下幾方面在促進(jìn)RIF 的過程：（1）刺激纖維細(xì)胞以及肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ各型膠原以及FN、層粘蛋白等。（2）通過降低ECM 降解酶的活性和增加降解酶抑制劑的活性減少ECM 的降解，如改變基質(zhì)金屬蛋白酶、纖溶酶原激活物、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑等的活性。（3）刺激腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，激活成纖維細(xì)胞，使生成的ECM 增多。TGF-β1 可以與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活多條細(xì)胞信號(hào)通路，與腎纖維化關(guān)系比較密切的是調(diào)控Smad 信號(hào)通路，誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)[4]。UUO 模型大鼠腎臟中，受體激活型信號(hào)介導(dǎo)分子Smad2 和Smad3 表達(dá)增高至正常水平的6 倍。受體抑制型信號(hào)分子Smad7 的蛋白水平則顯著降低，這些改變?cè)谀I間質(zhì)性纖維化的進(jìn)展中起到了重要作用[5]。因此，通過抑制TGF-β1 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以預(yù)防腎纖維化也是比較有效的手段。

1.2 肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量增多

肌成纖維細(xì)胞數(shù)量與腎纖維化的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。除了間質(zhì)成纖維細(xì)胞在多種細(xì)胞因子作用下由于過高的細(xì)胞反應(yīng)性而導(dǎo)致過度增殖外，腎小管上皮細(xì)胞、周細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞均可轉(zhuǎn)分化肌成纖維細(xì)胞[6]。

1.2.1 周細(xì)胞和成纖維細(xì)胞

成纖維細(xì)胞是具有分泌功能的間充質(zhì)細(xì)胞，存在于身體的各個(gè)器官和組織，在正常的腎臟中相對(duì)較少。合成的各種蛋白水解酶和抑制劑，使它們能夠調(diào)控ECM 的生成和更新。它們的數(shù)量在腎損傷后增加，并且它們可以被多種細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子特別是TGF-β1 或ECM 成分激活以分化成肌成纖維細(xì)胞。腎間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)收縮性肌纖維母細(xì)胞表型時(shí)，大量形成充滿間質(zhì)導(dǎo)致腎單位丟失和腎功能下降的纖維狀膠原豐富的細(xì)胞外基質(zhì)。肌成纖維細(xì)胞數(shù)量與腎纖維化的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[7]。

周細(xì)胞是支持脈管系統(tǒng)的基質(zhì)細(xì)胞，在腎臟中，周細(xì)胞在血管生成，腎髓質(zhì)和皮質(zhì)血流的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，并且在腎纖維發(fā)生中充當(dāng)間質(zhì)成肌纖維細(xì)胞的祖細(xì)胞。它們通過不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，并且在腎損傷后它的激活和從毛細(xì)血管分離對(duì)于驅(qū)動(dòng)腎纖維化進(jìn)展作用關(guān)鍵。Lan 等[8]的研究表明，血管損傷或血管因素是周細(xì)胞遷移和分化成肌成纖維細(xì)胞的最可能觸發(fā)因素。

1.2.2 腎小管上皮細(xì)胞

其中不少于1/3 的肌成纖維細(xì)胞是由腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來。在損傷的腎臟中，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程中，E-鈣粘蛋白的表達(dá)減少，粘附和極性的喪失[9]，腎小管上皮細(xì)胞中肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA 的表達(dá)增加，逐漸分化成間質(zhì)中的肌成纖維細(xì)胞[10]。在EMT 過程中，上皮細(xì)胞呈現(xiàn)間質(zhì)表型，通過降解基底膜和產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)降解酶破壞上皮層。另外還有許多因素促進(jìn)腎小管EMT的發(fā)生，包括氧化應(yīng)激、炎癥、成纖維細(xì)胞增殖和激活以及細(xì)胞凋亡等[11]。過去十幾年中關(guān)于EMT 是否能促進(jìn)腎間質(zhì)的纖維化一直存在爭(zhēng)議，現(xiàn)在一些新的研究結(jié)果表明EMT也是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的重要因素[12，13]。

1.3 腎間質(zhì)纖維化

在大鼠或小鼠完成UUO 手術(shù)后，進(jìn)展到嚴(yán)重腎實(shí)質(zhì)腎損傷發(fā)生在1～2 周。在TGF-β1 等多種因子作用下，成纖維細(xì)胞活化，纖溶酶原激活物抑制劑等基質(zhì)降解抑制酶激活，ECM 合成增多，基質(zhì)金屬酶和纖溶酶原激活物等基質(zhì)降解酶的活性受抑制，ECM 降解減少。最終細(xì)胞外基質(zhì)在腎小球和間質(zhì)區(qū)域中的異常和過度沉積，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的不可逆進(jìn)展，纖維連接蛋白、膠原蛋白等大量表達(dá)。此外，腎小管萎縮、毛細(xì)血管稀少和組織缺氧也加劇了纖維化的形成[14]。

2 基于UUO 模型的中藥研究進(jìn)展

近年來基于UUO 模型對(duì)于腎間質(zhì)纖維化的研究更加深化了我們對(duì)于其機(jī)制的認(rèn)識(shí)，但是目前我們?nèi)匀狈Ω行У姆乐文I纖維化的方法。中藥的使用起到了不錯(cuò)的效果，近年來一些有代表性的單味中藥和有效提取物以及中藥復(fù)方在UUO 模型上的研究如下。

2.1 抑制TGF-β1 水平及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

鄭龍等[15]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷能降低單側(cè)輸尿管梗阻后血清和腎組織中的TGF-β1 的水平，并抑制大鼠腎組織中的Smad2/3 磷酸化。體外研究也發(fā)現(xiàn)黃芩苷可以抑制Smad2/3 在相同TGF-β1 濃度下的磷酸化。使用大鼠建立的UUO 腎纖維化模型中，黃芩苷被證明通過抑制TGF-β1產(chǎn)生及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能降低纖連蛋白和膠原I mRNA表達(dá)水平，上調(diào)N-和E-鈣粘蛋白表達(dá)水平以及下調(diào)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和波形蛋白的表達(dá)，能抑制EMT 并顯著改善腎纖維化。

錢輝軍等[16]的研究證明，傳統(tǒng)的中草藥黃芪處理可減少TGF-β1 誘導(dǎo)的Smad2/3 磷酸化，抑制Smad 信號(hào)通路，顯著降低UUO 小鼠腎臟梗阻誘導(dǎo)的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白上調(diào)和E-cadherin 下調(diào)，抑制EMT 的誘導(dǎo)和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。在體外試驗(yàn)中，黃芪共處理也能逆轉(zhuǎn)TGF-β1 刺激的小鼠腎近端腎小管細(xì)胞系的α-SMA 高表達(dá)。

張娜等[17]研究證實(shí)，通心絡(luò)及其某些成分在UUO 模型上抑制腎纖維化或EMT 方面具有積極的作用。降低TGF-β1 和α-SMA的表達(dá)，抑制UUO引起的腎臟中smad2/3 的激活，恢復(fù)smad7 的表達(dá)，減少腎組織膠原沉積，減輕UUO 小鼠腎臟纖維化。姜黃素可以通過抑制TGFβ1 的下游介質(zhì)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子減緩成纖維細(xì)胞增殖，使其在細(xì)胞周期G1 期停滯，減少了ECM 積累，成為更有希望的治療纖維化藥物[18]。

中藥復(fù)方黃芪煎劑能改善UUO 小鼠腎纖維化，不僅能 下 調(diào)TGF-β1、TβRI、TβRII，Smad2/3，P-Smad2/3 的 表達(dá)，同時(shí)也能通過誘導(dǎo)Smad7 抑制TGF-β/Smad3 介導(dǎo)的腎纖維化[19]。綠茶多酚降低細(xì)胞外基質(zhì)積累減輕腎間質(zhì)纖維化，也是通過降低TGF-β1 和磷酸化Smad2 降低的水平實(shí)現(xiàn)的[20]。

2.2 抑制炎癥細(xì)胞因子

An 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒對(duì)UUO 誘導(dǎo)的腎纖維化的治療，是通過降低炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，降低TNF-α 和IL-1β，TGF-β1 以及纖連蛋白的表達(dá)，抑制多種炎癥因子的介導(dǎo)，降低炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。

黎穎等[22]的研究證實(shí)，補(bǔ)腎活血排毒法配伍的中藥復(fù)方各劑量組均明顯下降血肌酐、尿素氮。減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡、壞死、脫落，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理損傷。TUNEL法檢測(cè)，補(bǔ)腎活血排毒法中藥各劑量組可顯著減少細(xì)胞凋亡數(shù)目，明顯上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax 水平，升高iBcl-2／Bax比值，并且以上結(jié)果均呈劑量依賴性。改善了UUO 模型的腎臟損害，減輕了纖維化。

孟力強(qiáng)等[23]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪當(dāng)歸合劑的腎保護(hù)作用從病變?cè)缙谥委熀?d 開始，明顯減輕大鼠的腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化，同時(shí)可使腎組織中的TGF-β1 分泌減少，治療后7d 開始可減少腎間質(zhì)的α-SMA 表達(dá)、下降FN 表達(dá)，下降減少腎臟固有細(xì)胞轉(zhuǎn)化、分化及細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積并持續(xù)發(fā)揮作用，特征是通過減輕腎間質(zhì)纖維化從而改善腎功能。

同時(shí)也有研究[24]證明了當(dāng)歸補(bǔ)血湯可顯著減輕間質(zhì)膠原沉積和腎小管間質(zhì)損傷，降低膠原和α-SMA 水平。NLRP3、pro-caspase-1、白細(xì)胞介素-1β 的前體，白細(xì)胞介素-1β 同步表達(dá)降低。與依那普利相比，當(dāng)歸補(bǔ)血湯顯著減少腎小管間質(zhì)損傷、間質(zhì)膠原沉積以及I 型膠原和白細(xì)胞介素-1β 的表達(dá)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯在UUO 大鼠中提供的腎保護(hù)作用，與抑制NLRP3 炎性體表達(dá)和減少細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β 的分泌有關(guān)。

3 展望

自20 世紀(jì)70年代以來，UUO 的動(dòng)物模型就已經(jīng)用于進(jìn)行腎纖維化的研究，能模擬腎纖維化主要機(jī)制，制作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好?；赨UO 模型，對(duì)RIF 的發(fā)病機(jī)制又有了一些新的認(rèn)識(shí)，明確了轉(zhuǎn)分化等機(jī)制在細(xì)胞外基質(zhì)形成中的重要作用。很多中藥及中藥復(fù)方及單體能顯著抑制腎間質(zhì)的纖維化，減少細(xì)胞外間質(zhì)的累積，且大多通過抑制TGF-β1 和其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及炎癥細(xì)胞因子發(fā)揮抗纖維化的作用，更多中藥抗纖維化的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，是絕大多數(shù)慢性腎臟病的病理基礎(chǔ)，中藥抗纖維化的多靶點(diǎn)作用在腎纖維化的防治上有著很大的潛力。