趙焱

730046蘭州,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室生物安全委員會(huì)辦公室

在病毒的檢測(cè)領(lǐng)域，快速、靈敏、特異與準(zhǔn)確的鑒定方法始終是關(guān)注的焦點(diǎn)。通常，基于細(xì)胞培養(yǎng)的鑒定方法被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，但它需要數(shù)天時(shí)間才能完成，耗時(shí)、耗力。核酸檢測(cè)法也被廣泛地使用，最常見的方法是常規(guī)PCR、qPCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)等，但這些方法無法測(cè)定病毒的感染性。近些年，新檢測(cè)方法的研發(fā)從推陳出新的核酸結(jié)合染料中找到了新思維。疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)可用于病原體核酸提取前預(yù)處理樣品，使其共價(jià)交聯(lián)于失活病原體的核酸上并阻斷核酸擴(kuò)增，從而區(qū)分病原體是否存活[1]。目前，PMA-核酸檢測(cè)法可檢測(cè)活的病原體，如細(xì)菌[2]及其芽孢[3]、病毒[4-5]、寄生蟲[6]等，并應(yīng)用于不同的領(lǐng)域，如環(huán)境衛(wèi)生、食品安全、病原診斷等。

本文綜述了PMA-核酸檢測(cè)法的基本原理、步驟、優(yōu)勢(shì)與局限、各因素的影響及新進(jìn)展，旨在系統(tǒng)地總結(jié)測(cè)定病毒感染性的PMA-核酸檢測(cè)法，為其深入研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 基本原理

PMA是由Biotium公司發(fā)明的一種高親和力、光敏的核酸結(jié)合染料。在光解作用下，PMA上的光敏疊氮基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)楦叻磻?yīng)性的氮烯自由基，此氮烯自由基與結(jié)合位點(diǎn)的烴基極易形成穩(wěn)定的氮碳共價(jià)鍵，從而達(dá)到永久性的核酸修飾[7]。當(dāng)PMA修飾到核酸上后，其本身具有的微弱熒光變強(qiáng)，此熒光特性并非PMA-核酸檢測(cè)法的機(jī)理。其機(jī)理是共價(jià)修飾到核酸上的PMA阻礙了后續(xù)核酸檢測(cè)中核酸與引物等的配對(duì)，故而改變了被檢核酸的擴(kuò)增效率。另外，PMA與核酸共價(jià)交聯(lián)后，水分子與多余的游離PMA反應(yīng)終止了PMA的結(jié)合能力，生成的羥胺避免了后續(xù)DNA提取步驟中的額外修飾[8-9]。

PMA-核酸檢測(cè)法的另一個(gè)機(jī)理是PMA幾乎完全不可滲透細(xì)胞膜[7]，細(xì)胞膜的完整與否決定了PMA是否能接近并修飾核酸及其后續(xù)的檢測(cè)結(jié)果[10]。PMA可選擇性地穿過破損的病毒包膜與衣殼而結(jié)合到病毒核酸，由病毒結(jié)構(gòu)完整性區(qū)分了活病毒和失活病毒，從而測(cè)定了病毒的感染性。

2 PMA預(yù)處理步驟

與常規(guī)核酸檢測(cè)法相比，PMA-核酸檢測(cè)法在核酸提取的步驟前增加了PMA預(yù)處理[11]。PMA預(yù)處理病毒的方法是，根據(jù)PMA/病毒濃度比，將適量PMA加入病毒懸液后輕柔震蕩混勻，樣品室溫避光孵育5～10 min，再在特定光源的照射下曝光10～30 min，光源需距離樣品管10～20 cm，曝光期間樣品經(jīng)常輕柔震蕩混勻。

在PMA預(yù)處理的過程中，PMA選擇性地穿過破損的包膜與衣殼而共價(jià)修飾核酸，結(jié)合到核酸上的PMA阻礙了后續(xù)核酸檢測(cè)，從而達(dá)到測(cè)定病毒感染性的目的。另外，Parshionikar[12]利用此法檢測(cè)水樣中腸道病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)，即使樣品中有失活病毒存在仍能成功檢出活病毒。Bellehumeur證實(shí)[13]，PMA預(yù)處理含豬繁殖與呼吸綜合征病毒的臨床組織樣品后，宿主細(xì)胞的核酸成分被PMA交聯(lián)，其后續(xù)的核酸擴(kuò)增被阻斷，從而提高了DNA矩陣和高通量測(cè)序的病毒檢測(cè)靈敏性。

3 與其他測(cè)定病毒感染性方法的比較

樣品中病毒的檢測(cè)方法各有優(yōu)劣，但都被廣泛地應(yīng)用于不同的領(lǐng)域。在某些情況下，不僅病毒的量是期待獲得的數(shù)據(jù)，而且病毒的感染性更值得關(guān)注。即檢測(cè)數(shù)據(jù)同時(shí)來源于活病毒和失活病毒[14-15]，故直接測(cè)定活病毒的新方法逐漸被關(guān)注。

通常，測(cè)定病毒感染性的方法可分為兩類:第一類是基于病毒的復(fù)制能力，第二類是基于病毒的結(jié)構(gòu)完整性?；诓《緩?fù)制能力的方法包括動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[5，12，16]及細(xì)胞培養(yǎng)與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的聯(lián)用法[17]，依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可直接判定病毒的感染性，耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)且成本昂貴；而基于病毒結(jié)構(gòu)完整性的方法主要是衣殼蛋白氧化損傷的檢測(cè)[18]、酶處理-核酸檢測(cè)法[19]及PMA-核酸檢測(cè)法，這些方法相對(duì)簡(jiǎn)單、廉價(jià)，依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果只能提示病毒的感染性。與酶處理-核酸檢測(cè)法相比，PMA的化學(xué)特性比酶的更加穩(wěn)定，不易受其他成分的影響而變性，而且PMA預(yù)處理的時(shí)間更短，多余的PMA與水反應(yīng)而失活不會(huì)干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故PMA-核酸檢測(cè)法的應(yīng)用范圍更廣。PMA-核酸檢測(cè)法是一種結(jié)合病毒衣殼完整性和核酸穩(wěn)定性的預(yù)測(cè)病毒感染性的方法，但通過實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)選及與細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的關(guān)聯(lián)，其結(jié)果亦可直接判定病毒的感染性。

4 影響因素

4.1 病毒結(jié)構(gòu) 病毒的結(jié)構(gòu)成分包括核酸、衣殼和囊膜。病毒核酸上的烴基是光解作用下PMA的結(jié)合位點(diǎn)[7]。PMA-核酸檢測(cè)法已被用于巴爾的摩病毒分類系統(tǒng)中各主要類型的病毒，如I類(雙鏈DNA)的T4噬菌體和腺病毒、II類(單鏈 DNA)的ΦX174噬菌體、III類(雙鏈 RNA)的輪狀病毒、IV類(正鏈RNA)的脊髓灰質(zhì)炎病毒和諾如病毒等，可見此法受病毒核酸類型(DNA/RNA、單鏈/雙鏈、正鏈/負(fù)鏈)的影響不大[5，11-12，20-21]。

與囊膜相比，衣殼的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固、不易被破壞，能破壞衣殼的因素和強(qiáng)度通常也能完全破壞囊膜，因此本文中討論破壞病毒囊膜和衣殼的因素以衣殼為主。鼠諾如病毒衣殼由90個(gè)二聚體組成，每個(gè)二聚體是一個(gè)巨蛋白[22]。脊髓灰質(zhì)炎病毒衣殼由60個(gè)亞單位按二十面體對(duì)稱排列，每個(gè)亞單位包括4個(gè)病毒多肽，故其能夠在生理溫度經(jīng)受構(gòu)象的改變從而在衣殼完整的狀態(tài)下失去感染性[23]。各病毒衣殼結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致了病毒對(duì)各滅活方式的敏感性不同，成功的PMA-核酸檢測(cè)法中各病毒被滅活的溫度高低就印證了這一觀點(diǎn)[24]。例如，T4噬菌體的熱滅活溫度為110℃[8]，腸道病毒的熱滅活溫度為 37℃[12]，鼠諾如病毒的熱滅活溫度為72℃[24]。因此，對(duì)于不同病毒，PMA預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)條件不能混用，都需逐一摸索。

4.2 滅活方式 測(cè)定病毒感染性的PMA-核酸檢測(cè)法的首要關(guān)注點(diǎn)是囊膜或衣殼的完整性。與囊膜相比，衣殼的完整性更加穩(wěn)固、不易被破壞，所以無論病毒是否有囊膜，破壞衣殼的因素和程度是此法成敗的關(guān)鍵。常見破壞病毒的方法有高溫法、高壓法、紫外線法及氯滅活法[5，24-26]，各方法滅活病毒的原理不同，對(duì)衣殼完整性的影響也不盡相同，故并不完全適用于PMA-核酸檢測(cè)法。例如，紫外線僅破壞病毒的核酸[5]，不影響衣殼的完整性，故PMA-核酸檢測(cè)法不能預(yù)測(cè)紫外線滅活病毒的感染性。高壓僅引起衣殼蛋白的微小變化，并不足以保證PMA接近核酸，因此蛋白酶K與PMA共同預(yù)處理病毒可能改進(jìn)PMA-核酸檢測(cè)法[25]。

高溫法處理病毒是相對(duì)可靠、穩(wěn)定的方法，也是PMA-核酸檢測(cè)法中研究最多的滅活方式。高溫僅破壞病毒的衣殼蛋白[5]，不同溫度對(duì)衣殼蛋白的效應(yīng)迥異[12]，可歸納為三類:溫度足夠高而直接破壞了衣殼的完整性，PMA能進(jìn)入衣殼并交聯(lián)于核酸上，PMA-核酸檢測(cè)法能區(qū)分病毒是否存活；較高的溫度改變了病毒衣殼蛋白的構(gòu)象而不影響衣殼的完整性，故致病毒感染性喪失，細(xì)胞培養(yǎng)雖能分辨出病毒感染性，但PMA-核酸檢測(cè)法不能區(qū)分病毒是否存活；較低的溫度不破壞病毒衣殼而不能作為PMA-核酸檢測(cè)法的病毒滅活溫度。另外，由于各病毒的衣殼組成和結(jié)構(gòu)不同，相同溫度對(duì)各病毒的處理導(dǎo)致不同滅活結(jié)果[24]，故適用于PMA-核酸檢測(cè)法的病毒滅活溫度需通過實(shí)驗(yàn)摸索。

游離的氯對(duì)病毒核酸和衣殼都有顯著作用，通常氯最先損壞病毒核酸，隨著氯濃度或劑量的升高而破壞病毒蛋白[27]。Karim等[24]證實(shí)了，當(dāng)?shù)吐菴t值被用于滅活的鼠諾如病毒時(shí)，PMA-核酸檢測(cè)法并不適用；而當(dāng)高氯Ct值被應(yīng)用時(shí)，PMA-核酸檢測(cè)法成功地區(qū)分了感染性和氯滅活的鼠諾如病毒。因此氯滅活法對(duì)衣殼結(jié)構(gòu)的改變足以使PMA進(jìn)入并交聯(lián)于被滅活病毒的核酸上[5，12，24]。由于氯破壞核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)(如5’NCR)[25]，故需斟酌PCR擴(kuò)增區(qū)域以避免失敗。

4.3 實(shí)驗(yàn)條件 PMA-核酸檢測(cè)法的關(guān)鍵參數(shù)是PMA/病毒濃度比。最佳比值的選取應(yīng)該最大化抑制結(jié)構(gòu)破損病毒的信號(hào)，即PMA的量相對(duì)于病毒的量(或病毒核酸的量)要相對(duì)飽和，以保證所有的結(jié)構(gòu)破損病毒的核酸都能被PMA非特異性地封閉，同時(shí)過量的PMA與水反應(yīng)而失去活性。這能有效地抑制結(jié)構(gòu)破損病毒的核酸擴(kuò)增，而不影響結(jié)構(gòu)完整病毒的核酸擴(kuò)增。

影響PMA與樣本孵育的要素包括孵育時(shí)間和溫度。孵育時(shí)間需確保PMA滲透并交聯(lián)于核酸上。當(dāng)PMA/病毒濃度比值高時(shí)，孵育時(shí)間應(yīng)盡量縮短以免產(chǎn)生假陽(yáng)性；反之，孵育時(shí)間可靈活調(diào)節(jié)[1，28]。

在光照階段，為PMA光解反應(yīng)提供光源的是鹵素?zé)艄躘5]、光二極管[29]、Biotium的 PMA-Lite LED光解裝置[7]等，這些燈管的功率須符合實(shí)驗(yàn)要求。光照距離和時(shí)間是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)參數(shù)。光照時(shí)間決定了PMA的活化、與核酸的交聯(lián)及多余PMA結(jié)合能力的終止。充足的照射時(shí)間不僅滿足了PMA與核酸充分交聯(lián)的需要，而且通過終止多余PMA的結(jié)合能力保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可靠性。常規(guī)的照射時(shí)間小于30 min，但尚無確切的最優(yōu)照射時(shí)間報(bào)道。對(duì)于各實(shí)驗(yàn)，最優(yōu)照射時(shí)間需根據(jù)照射距離不斷地摸索、優(yōu)化。

5 總結(jié)

通常，病毒核酸片段的檢測(cè)結(jié)果不足以判定病毒的感染性。然而，無論病毒核酸的類型，PMA-核酸檢測(cè)法都能測(cè)定病毒的感染性。此法不僅受樣品處理方式、滅活方式等前處理方案的影響，而且被諸多的實(shí)驗(yàn)參數(shù)所干擾，如PMA/病毒濃度比、PMA孵育條件、光源的選擇及光照參數(shù)等。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化及與細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的關(guān)聯(lián)，其結(jié)果可更準(zhǔn)確地判定病毒的感染性。

PMA-核酸檢測(cè)法與細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)相比，更加簡(jiǎn)單、廉價(jià)，耗時(shí)更短，且不易受樣品中某些化學(xué)成分的干擾。與酶處理-核酸檢測(cè)法比較，PMA的化學(xué)特性比酶的更加穩(wěn)定，PMA預(yù)處理樣品的時(shí)間更短，多余的PMA與水反應(yīng)而不會(huì)干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故PMA-核酸檢測(cè)法更具有優(yōu)勢(shì)。另外，這種方法檢測(cè)病毒的種類更多，不僅可檢測(cè)感染細(xì)胞后致細(xì)胞病變的病毒，而且可檢測(cè)感染細(xì)胞后不致細(xì)胞病變的病毒和在細(xì)胞系上生長(zhǎng)不良的病毒。此法最大的特點(diǎn)是快捷，故其結(jié)果可為公共衛(wèi)生、應(yīng)急調(diào)查、高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室管理等提供及時(shí)、準(zhǔn)確的決策依據(jù)。

利益沖突無