董禎 溫紅玲

250012濟南,山東大學公共衛(wèi)生學院微生物檢驗學系感染性疾病防控重點實驗室(山東省“十三五”高校重點實驗室)

自1969年在美國加利福尼亞分離出來至今，EV71已在全世界發(fā)生過多次暴發(fā)和流行，是亞太地區(qū)最嚴重的嗜神經(jīng)病毒之一。EV71導致的手足口病(hand， foot and mouth disease，HFMD)大部分為自限性疾病，常表現(xiàn)為手足口部位的皰疹，重癥患兒可伴有腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣急性遲緩性麻痹、腦干腦炎等神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，部分患者出現(xiàn)肺出血、肺水腫甚至心肺衰竭等其他嚴重的全身性疾病，致殘率及病死率較高[1-2]。近年來，EV71發(fā)病率仍呈上升趨勢，且重癥感染較多，對嬰幼兒的生命健康造成了嚴重的威脅[2-3]。EV71屬于小RNA病毒科腸道病毒屬A組，為單股正鏈RNA病毒，基因組長約7 400 bp，兩端分別是保守的是5‘UTR和3’UTR，中間是編碼一個多聚蛋白的開放閱讀框(open reading frame，ORF)。該多聚蛋白在自身蛋白酶的作用下水解為結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒感染過程中發(fā)揮各自作用[4]。研究顯示EV71的非編碼區(qū)可以與宿主相互作用，能在病毒RNA合成的起始階段及蛋白翻譯過程中對病毒感染發(fā)揮重要的調(diào)控作用。因此，研究EV71非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)與功能的關系，對于揭示其致病機理及病毒的生命活動具有重要意義。

1 EV71 5′非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)及功能

1.1 5′UTR結(jié)構(gòu) EV71的5′UTR是病毒基因組較為保守的區(qū)域，能折疊成復雜的二級結(jié)構(gòu)，主要由6個莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop，SL)構(gòu)成。臨近5′末端的莖環(huán)Ⅰ是三葉草樣結(jié)構(gòu)(cloverleaf)，能與宿主蛋白發(fā)生相互作用，參與調(diào)控RNA的復制及合成，并且與維持病毒基因組結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關[5]。SLIISLVI共同組成內(nèi)部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)，以不依賴帽子結(jié)構(gòu)的方式與宿主細胞核糖體結(jié)合從而在病毒進入細胞后啟動病毒基因組的翻譯，并通過宿主因子調(diào)控病毒RNA的翻譯效率[6]。IRES中的SLIII和SLIV是相對保守的區(qū)域，SLII，SLV和SLVI則具有多變性，可能影響病毒毒力[7]。莖環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)部含有三個C-rich區(qū)，一個在SLII之前，另外兩個位于SLIV中。在SLV的下游還有一個富嘧啶(pyrimidine-rich)區(qū)，富嘧啶區(qū)的下游有一個沉默密碼子AUG，不能啟動高效率的翻譯，而真正的翻譯起始位點AUG位于其下游約150 bp處[8]。目前，在IRES的SLVI和第一個AUG密碼子之間沒有預測到RNA二級結(jié)構(gòu)，該區(qū)域被定義為“連接區(qū)”[9]。連接區(qū)可能通過與宿主蛋白相互作用調(diào)節(jié)IRES的活性進而調(diào)控病毒翻譯過程，但具體機制仍然未知。

1.2 5′UTR功能研究 小RNA病毒的IRES被分為4種類型，主要取決于它們需要輔助宿主蛋白在內(nèi)部招募核糖體的程度。EV71的IRES已被證明在功能上類似于Ⅰ型IRES，能與多種宿主蛋白相互作用，對病毒的復制和翻譯至關重要[10]。遠端上游結(jié)合蛋白1(FBP1)通過正調(diào)節(jié)IRES活性可作為病毒翻譯的正調(diào)控因子，而最新研究表明遠端上游結(jié)合蛋白3(FBP3)能夠通過結(jié)合EV71 5′UTR作為IRES相關作用因子(ITAF)并負調(diào)節(jié)病毒翻譯[6，9]。poly(C)結(jié)合蛋白1(PCBP1)通過與5′UTR相互作用正向調(diào)節(jié)EV71復制，其中SLI和SLIV空間結(jié)構(gòu)對PCBP1與病毒RNA結(jié)合尤為重要，可能影響病毒復制能力[11]。此外，異源核糖核蛋白(hnRNP)家族的成員，例如，聚嘧啶結(jié)合蛋白(PTB)，poly(C)結(jié)合蛋白2(PCBP2)，富含 AU的元件結(jié)合因子1(AUF1)等均被發(fā)現(xiàn)充當ITAF，通過與5′UTR不同區(qū)域結(jié)合直接調(diào)節(jié)IRES活性，但具體機制有待進一步研究[9，12]。

研究表明5′UTR某些位點突變可能使病毒復制能力、嗜神經(jīng)性甚至毒力發(fā)生一定的變化。Ma等[13]通過比較置換了5′UTR的EV71重組病毒與原病毒的生長曲線后發(fā)現(xiàn)，5′UTR能夠影響EV71復制能力且高溫下病毒復制能力有所下降，這提示可能存在EV71毒力位點或者高溫敏感位點。Yeh等[14]在EV71基因組的5′UTR的第158位點處進行點突變(C158U)后發(fā)現(xiàn)病毒復制能力降低，進一步通過ICR小鼠實驗發(fā)現(xiàn)病毒致病力減弱，這說明C158位點是EV71的毒力決定位點。張慧娟等[15]通過多個病毒序列比對發(fā)現(xiàn)，在5′UTR區(qū)中第254位堿基的突變(A254G)可能與EV71感染后引起的不同臨床癥狀有關。袁曉晶等[16]通過對EV71不同表型毒株基因組序列比對發(fā)現(xiàn)，分離自中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)累及的6個病毒株在5′UTR區(qū)第265 nt、703 nt兩處均發(fā)生了變異(G265A，G703T)，而輕癥HFMD來源的病毒株在該位點未發(fā)生變異。這些研究說明5′UTR某些位點突變能夠引起不同臨床結(jié)局，可能與EV71的致神經(jīng)毒性作用有關，可作為潛在的毒力位點進一步研究。

Wen等[16]通過基因序列對比發(fā)現(xiàn)EV71輕癥株和重癥株5′UTR之間的二級結(jié)構(gòu)具有明顯區(qū)別。Li等[17]比對25株EV71重癥分離株與31株輕癥株的序列發(fā)現(xiàn)5′UTR內(nèi)3處堿基位置上的核苷酸(nt272G，nt488U，nt700 A/U)發(fā)生了一致性改變，二級結(jié)構(gòu)分析顯示nt488U突變引起SLIII的穩(wěn)定性發(fā)生改變，進而導致病毒毒力變化引起不同表現(xiàn)型。Kok等[18]將 EV71的 5′UTR替換成鼻病毒(rhinovirus)的5′UTR后發(fā)現(xiàn)病毒復制能力變?nèi)?，然而多次細胞傳代后恢復了親本的復制能力，分析其二級結(jié)構(gòu)認為U461C突變增加了SLV區(qū)域GC配對含量，使二級結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，從而提高了翻譯效率使得病毒復制增強。Jia等對EV71強毒株的IRES二級結(jié)構(gòu)預測表明，GP114→CP114和GP151→TP151突變有助于在SLII中形成獨特的RNA二級結(jié)構(gòu)，可能導致病毒毒力增強[19]。最新研究表明，SLII內(nèi)部堆疊形成保守的5′-AUAGC-3′凸環(huán)結(jié)構(gòu)是病毒翻譯和復制的關鍵決定因素，當內(nèi)部堿基突變后病毒復制能力降低，刪除凸環(huán)結(jié)構(gòu)則病毒完全失去感染RD細胞的能力[20]。人異源核糖核蛋白(hnRNP A1)與SLII相互作用形成特異性復合物，SLII凸環(huán)等結(jié)構(gòu)突變能改變復合物的穩(wěn)定性，嚴重影響病毒翻譯和復制能力[21]。另有研究初步表明，從重癥以及死亡患者分離出的EV71毒株的5′UTR RNA二級結(jié)構(gòu)比輕癥毒株的二級結(jié)構(gòu)更加復雜和緊湊，尤其是在IRES的SLIV區(qū)，且重癥株有比輕癥株具有更多莖環(huán)結(jié)構(gòu)[22]。目前對EV71復制能力及毒力與5′UTR二級結(jié)構(gòu)改變的關系研究逐漸增多，但由于其序列復雜且結(jié)構(gòu)具有高度靈活性，其三維結(jié)構(gòu)仍然未知，今后對空間三維折疊構(gòu)象的深入分析是必不可少的一方面。

研究發(fā)現(xiàn)位于三葉草結(jié)構(gòu)與SLII之間的非莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)第104位堿基是柯薩奇病毒16型(CA16)的毒力決定位點，與病毒復制有關并且影響由IRES介導的翻譯活性[23]。同一區(qū)域內(nèi)，脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus，PV)第103位堿基由A突變?yōu)镃后病毒的毒力發(fā)生衰減，并且喪失了在神經(jīng)細胞上的溫度敏感表型[24]。另有研究者發(fā)現(xiàn)，在三葉草結(jié)構(gòu)與IRES之間的部分堿基與三葉草結(jié)構(gòu)之間存在協(xié)同作用，通過增加宿主蛋白結(jié)合的能力調(diào)節(jié)病毒復制[25]。另外，對于連接區(qū)研究較少，目前認為連接區(qū)可以促進IRES三級結(jié)構(gòu)的形成，對病毒構(gòu)象有重要意義，該區(qū)域的變異可能對毒力也有一定影響。這提示我們不能忽略對IRES以外的其他區(qū)域的堿基突變和空間結(jié)構(gòu)的關注。

2 EV71 3′非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)及功能

2.1 3‘UTR結(jié)構(gòu) EV71的3’UTR也是高度保守的非編碼區(qū)的一部分，它具有多種高度復雜的空間結(jié)構(gòu)，此區(qū)域可能包含病毒基因組復制的調(diào)控位點。3′UTR的核心結(jié)構(gòu)是由堿基互補配對折疊形成的兩個莖環(huán)結(jié)構(gòu)域(stem-loop domains，SLDs)，分別稱為X和Y。這兩個結(jié)構(gòu)域的長度是保守的，分別由8個堿基對和12個堿基對組成。3′UTR一端由遺傳編碼的poly(A)尾部組成，其部分包含在結(jié)構(gòu)域X的莖中[26]。X和Y結(jié)構(gòu)域的環(huán)區(qū)與環(huán)外的堿基配對可進一步形成互補假結(jié)體，把這種能相互作用并且類似“吻型”(kissing interaction)的高級結(jié)構(gòu)命名為結(jié)構(gòu)域K。結(jié)構(gòu)域K的穩(wěn)定性不高，常以變換折疊的不同結(jié)構(gòu)存在。近期研究發(fā)現(xiàn)，3′UTR除了X和Y兩個莖環(huán)外還具有特殊的“Z型”結(jié)構(gòu)域(SLDZ)。根據(jù)核苷酸序列的長短分為兩組，EV71 B3和C4亞型與 CVA4，CVA14和 CVA16等攜帶Ⅰ組SLD-Z，EV71原型株BrCr與其余亞型都攜帶Ⅱ組SLD-Z。實驗數(shù)據(jù)表明，SLD-Z是EV71和A型柯薩奇病毒16(CVA16)進化重組的標記[18，27]。值得一提的是，SLD Z的缺失能夠?qū)е虏《驹谏窠?jīng)元細胞(SH-SY5Y)的特異性生長缺陷，很可能與神經(jīng)毒力有關[28]?！癦型”結(jié)構(gòu)域在病毒的復制過程中也可能發(fā)揮其他作用，但目前未見報道。

2.2 3′UTR功能及探究 目前研究認為，3′UTR可能與病毒的進化和適應存在一定關聯(lián)，部分序列結(jié)構(gòu)缺失可能導致病毒感染性降低[29]。Kok等[18]刪除EV71和鼻病毒2嵌合體的3′UTR的17個堿基后，病毒的生長能力大幅度下降。Brown等[30]構(gòu)建了刪除鼻病毒和PV的3′UTR的缺失突變體，然后用突變體感染Hela細胞，結(jié)果表明缺失突變體感染HeLa細胞的能力降低，細胞出現(xiàn)病變的時間推遲[30]。

作為非編碼區(qū)的一部分，3′UTR二級結(jié)構(gòu)對RNA的起始要比堿基組成對于RNA的起始更為重要，增加二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性可以提高翻譯中涉及的蛋白質(zhì)的結(jié)合，這又可以提高翻譯效率。有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)域K內(nèi)個別堿基錯配造成的扭曲能導致病毒對溫度敏感甚至死亡，如果結(jié)構(gòu)域K中一條鏈被互補相似物取代則病毒復制被阻斷[31]。這種特殊的結(jié)構(gòu)域K可能為翻譯起始因子和核糖體相互識別提供了結(jié)合位點，也可能激活IRES活性進而影響病毒翻譯過程，對EV71結(jié)構(gòu)域K的功能研究需要找到特定作用位點再聯(lián)合其三維結(jié)構(gòu)進一步分析。目前，對3′UTR結(jié)構(gòu)和功能的研究還處于起步階段，常用手段就是結(jié)構(gòu)預測后進行突變分析。但是對3′UTR功能的剖析常常受到病毒復制過程中各種因素的阻礙，我們需要通過進一步研究來明確EV71與宿主的相互作用及其空間構(gòu)象變化對病毒的影響機制。

3 小結(jié)

在過去的幾十年里，國內(nèi)外學者對小RNA病毒基因組非編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能進行了大量研究，其研究成果對我們了解EV71病毒基因組的復制，蛋白翻譯及病毒包裝釋放等生命過程具有重要意義。EV71高度保守且空間結(jié)構(gòu)復雜的非編碼區(qū)在入侵宿主細胞后的翻譯及復制過程中的作用不可或缺的，能直接或間接影響病毒的毒力和感染力。隨著對EV71研究的逐漸廣泛深入和研究技術(shù)的日益發(fā)展，非編碼區(qū)的功能及分子機制將逐步揭示。

利益沖突 無