□ 劉永嘉 單 非 阜新市檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心

隨著時(shí)代的發(fā)展，食品安全愈加被社會(huì)大眾所關(guān)注，而與食品安全密切相關(guān)的食品檢驗(yàn)就顯得至關(guān)重要。分子生物學(xué)顧名思義，從分子水平研究生命本質(zhì)，以微觀視野分析生命現(xiàn)象。其中PCR技術(shù)在食品微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域具有不可取代的積極作用。

1 PCR技術(shù)的時(shí)代背景與意義

食品微生物檢驗(yàn)的技術(shù)手段日益更新，常規(guī)檢驗(yàn)方法不斷優(yōu)化（如各種顯色培養(yǎng)基、生化鑒定試劑條等）[1]，酶聯(lián)免疫法逐漸成熟[2]，分子生物學(xué)手段也沒有缺席，理所當(dāng)然地在食品檢驗(yàn)領(lǐng)域成為熱點(diǎn)。PCR是20世紀(jì)80年代中期開始發(fā)展的特定核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，至今PCR已經(jīng)日趨成熟。可以說，在食品微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域PCR技術(shù)已經(jīng)取得了顯著的成績，同時(shí)也存在著一些問題，使得這項(xiàng)技術(shù)沒有被更普遍地使用，但這并不影響食品檢驗(yàn)者對它的熱情。因?yàn)閷ξ⑸锉举|(zhì)核酸的探索，讓食品微生物檢驗(yàn)進(jìn)入了另外一個(gè)層次，這也必將大大地推動(dòng)食品微生物檢驗(yàn)事業(yè)的進(jìn)步。

2 傳統(tǒng)PCR

2.1 傳統(tǒng)PCR的原理

PCR的工作原理就是以目標(biāo)核酸分子為模板，設(shè)計(jì)與模板核酸相匹配的單鏈核酸片段作為引物，在核酸聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制原則合成新的核酸。

2.2 傳統(tǒng)PCR技術(shù)在食品微生物檢驗(yàn)中的特點(diǎn)

用傳統(tǒng)PCR法檢測食品中金黃色葡萄球菌[3]、食品中沙門氏菌[4]等都取得了成功。樣品懸液制備完成后，首先要進(jìn)行核酸的提取，然后進(jìn)行選擇性擴(kuò)增（PCR），最后進(jìn)行凝膠電泳并觀察記錄。該方法對無菌環(huán)境和無菌操作沒有太高的要求，可以對多個(gè)樣品的目標(biāo)菌同時(shí)進(jìn)行檢測，從而完成大批量的檢測任務(wù)，具有很好的特異性、敏感性強(qiáng)，并且比常規(guī)方法更簡單。

2.3 傳統(tǒng)PCR技術(shù)應(yīng)用于食品微生物檢驗(yàn)時(shí)存在的問題

在食品微生物檢驗(yàn)過程中，傳統(tǒng)PCR法仍然存在假結(jié)果的可能。這是因?yàn)?，一方面在樣品中可能存在干擾因素或者抑制因素，以及聚合酶鏈反應(yīng)效率差異很大，需要根據(jù)不同的因素設(shè)計(jì)優(yōu)化反應(yīng)條件，影響因素和反應(yīng)條件的不同都會(huì)使得目標(biāo)核酸的擴(kuò)增不理想；另一個(gè)方面，在進(jìn)行凝膠電泳準(zhǔn)備工作時(shí)，人員操作的準(zhǔn)確性、時(shí)效性對于結(jié)果有著顯著的影響，增加了結(jié)果的不確定度。

3 熒光定量PCR

3.1 熒光定量PCR的原理

熒光定量PCR就是在反應(yīng)體系中加入熒光因子監(jiān)測熒光信號(hào)的變化過程，最后利用專業(yè)軟件對目標(biāo)核酸模板進(jìn)行定量分析。

3.2 食品微生物檢驗(yàn)中熒光定量PCR與傳統(tǒng)PCR的比較

熒光定量PCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR方法的基礎(chǔ)上發(fā)展出來的檢驗(yàn)技術(shù)，在金黃色葡萄球菌[5]、芽孢桿菌[6]、大腸桿菌[7]等的食品微生物檢驗(yàn)中都取得了成熟的經(jīng)驗(yàn)。與傳統(tǒng)PCR比較，該方法在結(jié)果讀取分析上進(jìn)行了改進(jìn)，更簡單、更快速、靈敏度更強(qiáng)。彌補(bǔ)了傳統(tǒng)PCR 定性檢測的一些不足，全過程采用閉管操作，用光譜技術(shù)代替凝膠電泳來呈現(xiàn)結(jié)果，減少了人員操作帶來不利影響的機(jī)會(huì)，降低了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的可能性，有效地避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，同時(shí)對熒光信號(hào)累積過程進(jìn)行監(jiān)測分析，可以實(shí)現(xiàn)對樣本中目標(biāo)菌的定量檢測[8]。但依然沒有解決傳統(tǒng)PCR在擴(kuò)增過程中，放大干擾因素或者存在抑制因素的問題。

4 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

4.1 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)根據(jù)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，核酸鏈在某一恒溫條件下達(dá)成解鏈和退火的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，因此可以在一個(gè)溫度下完成核酸的擴(kuò)增。

4.2 食品微生物檢驗(yàn)中環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法與熒光定量PCR法的比較

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增是2000年由Notomi 等[9]發(fā)明的一種新式的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，目前已經(jīng)在阪崎腸桿菌[10]、副溶血性弧菌[11]、金黃色葡萄球菌[12]等的食品微生物檢測中取得不錯(cuò)的效果。熒光定量PCR法與環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法都可以比較準(zhǔn)確地檢出目標(biāo)菌，但相對于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法，熒光定量PCR法需要質(zhì)量更高的核酸模板，需要更長的檢測時(shí)間，需要更精密的儀器設(shè)備，相反環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法用時(shí)短、成本低，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法更適合現(xiàn)場的快速監(jiān)督抽檢[13]。

5 討論

PCR技術(shù)是分子生物學(xué)的重要手段，引入了光譜技術(shù)后，發(fā)展出熒光定量PCR方法，在結(jié)果收集分析階段，以熒光信號(hào)為標(biāo)的，有較好的特異性、敏感度。熒光定量PCR方法全程閉管操作，減少了與外界接觸的機(jī)會(huì)，降低了實(shí)驗(yàn)室污染的可能性，這在操作程序上顯得更優(yōu)化、更科學(xué)。但相比常規(guī)檢驗(yàn)方法，仍然存在儀器設(shè)備昂貴等問題。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增另辟蹊徑不同于常規(guī)PCR需要多個(gè)溫度完成核酸的擴(kuò)增，而是在恒溫下達(dá)到核酸擴(kuò)增的目的，用時(shí)更短、成本更低，同時(shí)依然有很好的特異性和敏感度。那么，將環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法與熒光定量所用到的光譜技術(shù)結(jié)合起來，用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法進(jìn)行核酸復(fù)制，在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，然后監(jiān)測熒光信號(hào)，進(jìn)行分析得出結(jié)果[14]。這樣就可以整合熒光定量PCR方法的優(yōu)點(diǎn)和環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法的長處，得到更加普遍使用的食品微生物檢驗(yàn)分子生物學(xué)技術(shù)方法。

6 結(jié)語

熒光環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法仍然還有很多地方需要完善，未來有很大的發(fā)展空間，是未來食品微生物檢驗(yàn)應(yīng)用分子生物學(xué)方法研究發(fā)展的方向，也勢必會(huì)成為食品微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域至關(guān)重要的技術(shù)手段，為食品安全保駕護(hù)航。