林夏妃，朱昭瓊

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563099)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病在多方面影響人類的生存質(zhì)量。目前中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方法有藥物治療、深部腦刺激技術(shù)(deep brain stimulation,DBS)等。但是藥物治療缺乏時(shí)間上的特異性，深部腦刺激術(shù)缺乏空間上的特異性，兩者都不能同時(shí)兼?zhèn)鋾r(shí)間空間特異性的特點(diǎn)，不能精確地定位到靶細(xì)胞中。2016年，Towne和Thompson將光遺傳學(xué)定義為一種使用光控制活體組織中細(xì)胞的方法，通常為表達(dá)了光敏蛋白的神經(jīng)元細(xì)胞[1]。光遺傳學(xué)技術(shù)為精確控制細(xì)胞功能提供了可能性。本文主要介紹光遺傳學(xué)技術(shù)的基本原理，及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷和治療方面的應(yīng)用進(jìn)展。光遺傳學(xué)(optogenetics)這一概念由Deisseroth等于2006年首次提出，并于2011年被《Nature Methods》雜志評為2010年度技術(shù)[2-3]。

1 光遺傳學(xué)技術(shù)

光遺傳學(xué)技術(shù)的主要特點(diǎn)是光學(xué)與遺傳學(xué)相結(jié)合，通過光來控制神經(jīng)元的生物學(xué)功能[4]。光遺傳學(xué)技術(shù)主要由三部分組成：即光敏蛋白、運(yùn)載體以及光刺激系統(tǒng)。光遺傳學(xué)技術(shù)是通過病毒運(yùn)載體將光敏蛋白表達(dá)于靶細(xì)胞膜上，通過光照來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞功能的精細(xì)調(diào)控。

1.1 光敏蛋白 光敏蛋白是一種跨膜蛋白，其在特定波長光照射下，引起離子跨膜運(yùn)動。光敏蛋白主要以視紫紅質(zhì)通道蛋白2(Channelrhodopsin-2,ChR2)和嗜鹽菌紫質(zhì)(Halrohodopsin,NpHR)為代表。前者為鈉離子通道，可通過藍(lán)光照射使細(xì)胞膜去極化引起細(xì)胞興奮；后者為氯離子泵，通過黃光照射使細(xì)胞膜超級化抑制細(xì)胞的興奮性[5]。近年來，還發(fā)現(xiàn)了視蛋白嵌合受體(OptoXRs)，是由視蛋白和G蛋白偶聯(lián)信號組成，在光照下能引起細(xì)胞興奮去極化[6]。Boyden等提出了兩種新型通道蛋白，分別為能被紅光激活的Chrimson和能被藍(lán)光激活的Chronos，兩者都可以調(diào)節(jié)特定神經(jīng)元的活動，但Chronos比Chrimson對暗光更加敏感[7]。

1.2 光敏蛋白運(yùn)載體 光敏蛋白基因被轉(zhuǎn)運(yùn)并穩(wěn)定地表達(dá)于靶細(xì)胞中是光遺傳學(xué)技術(shù)的關(guān)鍵問題。而光敏蛋白基因植入到靶細(xì)胞中，需要光敏蛋白運(yùn)載體參與。光敏蛋白基因常用的運(yùn)載體主要有兩種，即病毒和轉(zhuǎn)基因動物。常用病毒運(yùn)載體有腺病毒、慢病毒[8]。腺病毒相關(guān)載體可以使基因表達(dá)在廣泛區(qū)域中，而慢病毒相關(guān)載體可以使基因在靶細(xì)胞中較為長期而穩(wěn)定地表達(dá)。目前已經(jīng)成功構(gòu)建表達(dá)ChR2和NpHR以及表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠[9-10]?？赏ㄟ^免疫熒光成像等技術(shù)檢測光敏蛋白基因是否成功表達(dá)于靶細(xì)胞中。

1.3 光刺激系統(tǒng) 表達(dá)了光敏蛋白的靶細(xì)胞，需要光照才能被激活。在離體實(shí)驗(yàn)中，常使用的光源為發(fā)光二極管和過濾光。發(fā)光二極管包括鹵素光源、氙氣光源和微小發(fā)光二極管(LED)[11]。而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，主要應(yīng)用激光等過濾光，利用光導(dǎo)纖維，精確地將光束導(dǎo)入到所研究的大腦區(qū)域附近，雖然侵入性更強(qiáng)，但可更加詳盡地了解大腦深部結(jié)構(gòu)，為研究神經(jīng)活動如何導(dǎo)致行為學(xué)改變提供幫助[12]。

2 光遺傳學(xué)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用與進(jìn)展

2.1 光遺傳學(xué)在癲癇中的應(yīng)用 癲癇是由一組神經(jīng)元過度同步性異常放電所引起的慢性腦部疾病，由中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性與抑制性失衡引起。目前癲癇的主要治療方法為藥物治療，但仍有部分患者對藥物治療效果不理想，發(fā)展為藥物難治性癲癇。傳統(tǒng)的抗癲癇藥物在癲癇神經(jīng)回路中針對特定的細(xì)胞類型顯示出欠缺的特異性。許多神經(jīng)元在癲癇發(fā)作期間的過度興奮是動態(tài)的，需要對神經(jīng)活動進(jìn)行精確時(shí)間控制以進(jìn)行有效的治療[13]。而光遺傳學(xué)技術(shù)具有時(shí)間和空間上特異性，可以精準(zhǔn)定位到一組或單個的神經(jīng)元細(xì)胞中，能夠進(jìn)一步研究癲癇的發(fā)病機(jī)制。

Tonnesen和Skhotinsky分別在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)了癲癇模型，運(yùn)用載體使NpHR基因表達(dá)于海馬上，結(jié)果顯示，通過黃光照射可以縮短癲癇的發(fā)作時(shí)間[14-15]。谷氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)中作用最廣泛的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，體內(nèi)濃度過高時(shí)神經(jīng)元過度興奮，易引起癲癇發(fā)作。體內(nèi)谷氨酸維持正常的濃度主要靠星形膠質(zhì)細(xì)胞的攝取[16]。有一部分患者由于星形膠質(zhì)細(xì)胞的攝取功能障礙而發(fā)展成難治性癲癇，因此研究者選用星形膠質(zhì)細(xì)胞作為靶細(xì)胞表達(dá)ArchT基因，減少神經(jīng)元胞外谷氨酸濃度，成功抑制過度興奮的神經(jīng)元放電[17]。

深部腦刺激通過提高網(wǎng)狀丘腦核γ-氨基丁酸(GABA)能抑制性神經(jīng)元的強(qiáng)度，縮短癲癇的發(fā)作持續(xù)時(shí)間，表明丘腦是調(diào)節(jié)皮層癲癇發(fā)作的重要部位。通過在小鼠丘腦表達(dá)ChR2通道蛋白，用皮層電刺激誘發(fā)癲癇樣發(fā)作，丘腦區(qū)域用藍(lán)色光刺激，結(jié)果顯示高頻率(100赫茲)和長時(shí)間的光刺激，可以有效地抑制胼胝體誘發(fā)的癲癇樣活動，表明在丘腦區(qū)的GABA受體可能參與抑制癲癇樣發(fā)作[18]。

癲癇猝死(sudden unexpected death in epilepsy,SUDEP)是癲癇患者突然發(fā)生的一種致死性的并發(fā)癥[19]。癲癇發(fā)作引起的呼吸驟停(Seizure-induced respiratory arrest ,S-IRA)是癲癇猝死的重要原因，而聲刺激是誘發(fā)S-IRA發(fā)作的重要因素[20]。研究者利用光遺傳學(xué)技術(shù)選擇性激活小鼠的5-HT神經(jīng)元，5-HT神經(jīng)元刺激中腦背核(DR)，明顯降低了聲刺激誘發(fā)的癲癇發(fā)作引起呼吸驟停的發(fā)生率。研究結(jié)果表明，小鼠癲癇發(fā)作引起的呼吸驟停(S-IRA)與中腦背核(DR)的5-HT能神經(jīng)元的神經(jīng)傳遞有關(guān)，所以運(yùn)用光遺傳學(xué)技術(shù)預(yù)防SUDEP是有可能實(shí)現(xiàn)的[21]。

2.2 光遺傳學(xué)在帕金森病中的應(yīng)用 帕金森病(Parkinson's disease,PD)是由黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性引起的好發(fā)于老年人的腦部疾病，臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動遲緩、姿勢平衡障礙以及與之伴隨產(chǎn)生的焦慮、抑郁、記憶力減退和各種自主神經(jīng)癥狀。帕金森病目前主要通過藥物治療，包括左旋多巴、金剛烷胺等，但是藥物治療也產(chǎn)生許多副作用。近年來，深部腦刺激術(shù)也逐漸在臨床中應(yīng)用，但其缺乏空間特異性，不能精確地定位到靶細(xì)胞中。光遺傳學(xué)的出現(xiàn)，能讓我們從神經(jīng)元及神經(jīng)回路的水平上更深一步地了解帕金森病的發(fā)病機(jī)制以及對其診斷和治療方面有新的認(rèn)識。帕金森病主要病變區(qū)是黑質(zhì)紋狀體，故治療帕金森病的運(yùn)動障礙，紋狀體是關(guān)注的一個主要區(qū)域。GABA能中等多棘神經(jīng)元(medium spiny neuron,MSNs)是紋狀體中主要分布的神經(jīng)元，分為直接通路(direct pathway)上的MSNs(dMSNS)和間接通路(indirect pathway)上的MSNs (IMSNs)，構(gòu)成直接通路和間接通路。Kravitz等研究表明，刺激間接通路會產(chǎn)生帕金森病樣癥狀，出現(xiàn)冰凍行為和動作遲緩，而激活直接通路則可改善小鼠僵直行為和動作遲緩癥狀[22]。光遺傳學(xué)技術(shù)允許在體內(nèi)精確快速地激動紋狀體，從而在一定程度上控制帕金森病癥狀。

α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)及其突變體是一個已知的與帕金森病直接相關(guān)的小型突觸前蛋白，突變的a-Syn過度表達(dá)會導(dǎo)致多巴胺的釋放減少，從而導(dǎo)致運(yùn)動功能障礙[23]。研究者利用果蠅幼蟲遺傳模型來研究多巴胺釋放減少是否會誘發(fā)帕金森病相關(guān)癥狀(即運(yùn)動減慢等)。實(shí)驗(yàn)者敲除了果蠅多巴胺神經(jīng)元基因，造成了果蠅幼蟲的運(yùn)動障礙。把表達(dá)ChR2的敲除了多巴胺神經(jīng)元基因的果蠅，急性(1 min)和長時(shí)間(1～12h)暴露于波長為470nm的藍(lán)光下，均可改善帕金森相關(guān)的運(yùn)動障礙癥狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，光激活ChR2可以改善由于多巴胺突觸傳遞障礙引起的帕金森病癥狀[24]。

2.3 光遺傳學(xué)在阿爾茲海默病及術(shù)后認(rèn)知功能障礙中的應(yīng)用 阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種起病隱匿，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力損傷的神經(jīng)退行性疾病。了解AD的發(fā)病機(jī)制，可以預(yù)防或者改善AD的癥狀，改善老年人的生活質(zhì)量。AD的發(fā)生與多種因素相關(guān)，如tau蛋白異常磷酸化、β淀粉樣蛋白(Aβ)過度沉積、神經(jīng)元凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等[25-26]。研究表明，活性氧可以激活Ca2+通道，大量Ca2+內(nèi)流從而使Ca2+依賴性蛋白激酶與蛋白磷酸酶比例失衡，從而促進(jìn)tau蛋白異常磷酸化，加速AD的發(fā)生[27]。

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction，POCD)的發(fā)病癥狀與AD的臨床表現(xiàn)相似，都有學(xué)習(xí)及記憶力能力減退的癥狀。有研究表明全麻藥物等圍術(shù)期的因素可以從不同方面增加患者POCD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[28-29]。線粒體功能可受全身麻醉藥物的影響，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的損傷，不僅能夠造成活性氧自由基(ROS)的積聚，還能促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放，導(dǎo)致線粒體中Ca2+水平顯著提高[30]。線粒體中的Ca2+濃度的增高可以引起線粒體內(nèi)與細(xì)胞凋亡相關(guān)物質(zhì)的釋放，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[31]，從而造成POCD。吸入麻醉藥通過激活GABA受體，抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-articulatory acid receptor，NMDAR)而發(fā)揮中樞性麻醉作用，有研究表明吸入麻醉藥影響老年大鼠的記憶能力可能與海馬區(qū)NMDAR1表達(dá)下降有關(guān)[32]。因此，吸入麻醉藥導(dǎo)致的POCD的機(jī)制可能與NMDAR受體有關(guān)。利用光遺傳學(xué)技術(shù)激活體內(nèi)被抑制的相關(guān)受體能否能改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力還有待進(jìn)一步研究。光遺傳學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)也許能讓我們更深一步地了解POCD。

3 展望

大腦運(yùn)動、感覺、認(rèn)知功能取決于連接神經(jīng)元和網(wǎng)絡(luò)之間相互作用。故研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制要在神經(jīng)元水平上才能更加精確。光遺傳學(xué)技術(shù)兼具時(shí)間空間特異性的特點(diǎn)，能夠在神經(jīng)元以及神經(jīng)環(huán)路水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)制。光遺傳學(xué)技術(shù)是研究大腦和行為之間聯(lián)系的可靠工具，我們可以利用光遺傳學(xué)這一特點(diǎn)，在現(xiàn)有的水平上更加深入地研究POCD。而功能性光成像技術(shù)和光遺傳學(xué)的聯(lián)合應(yīng)用，可以從Ca2+水平方面進(jìn)一步研究POCD的發(fā)病機(jī)制。

光遺傳學(xué)技術(shù)現(xiàn)在面臨的主要障礙是從實(shí)驗(yàn)室到臨床的應(yīng)用。光遺傳學(xué)在檢測和治療疾病的過程中，一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)是需要把光敏蛋白基因轉(zhuǎn)入到患者體內(nèi)并使其穩(wěn)定的表達(dá)，目前主要面臨以下幾個問題：①在神經(jīng)元表達(dá)光敏蛋白非侵入性的方法；②如何準(zhǔn)確評估光敏蛋白在體內(nèi)表達(dá)水平；③光敏蛋白是一種外源性蛋白抗原，患者自身存在對其的免疫反應(yīng)該如何解決。盡管光遺傳學(xué)在臨床上應(yīng)用仍有許多挑戰(zhàn)，但仍可安全有效地運(yùn)用于靈長類動物中[33-34]。在臨床試驗(yàn)中腺相關(guān)病毒在患者體內(nèi)成功注射，證明了其安全性[35]。因此光遺傳學(xué)技術(shù)的產(chǎn)生，為研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機(jī)制提供了新方法。