宋吉軒， 李 云， 李 標(biāo)， 鄧仁菊， 李 麗

（貴州省生物技術(shù)研究所， 貴陽550006）

甘薯屬旋花科甘薯屬一年生作物，由于塊根產(chǎn)量高、適應(yīng)性廣，是重要的糧食、飼料、工業(yè)原料及生物能源作物之一。而紫心甘薯薯肉一般為紫色或深紫色，除含有普通甘薯各種營養(yǎng)成分外，還富含有豐富的花青素，由于花青素具有特殊的功能，從而表現(xiàn)出一些特有的生理活性和功能［1］。有研究表明，紫心甘薯具有抗氧化、保肝和改善視力等功能，同時還能降低血清中的相關(guān)酶，對高血壓等心血管病有較好的預(yù)防功能［1－2］。

ISSR分子標(biāo)記在作物種質(zhì)資源鑒定、分類及親緣關(guān)系分析等中有重要的應(yīng)用，對研究材料的背景要求不嚴(yán)，且具有引物設(shè)計簡單、多態(tài)性高、重復(fù)性好和結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)［3］，在一些作物種質(zhì)資源鑒定和親緣關(guān)系研究中進(jìn)行了相應(yīng)的應(yīng)用［4－5］。同時，ISSR分子標(biāo)記在甘薯遺傳多樣性等方面獲得了肯定，并有較高的分辨力［6］。目前利用ISSR分子標(biāo)記分析貴州紫心甘薯種質(zhì)資源的遺傳多樣性還未見報道。本研究利用ISSR分子標(biāo)記對23份貴州紫心甘薯種質(zhì)資源的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，初步了解紫心甘薯材料間的親緣關(guān)系，為貴州省選育紫心甘薯新品種，提高育種效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)材料為引進(jìn)和新選育的貴州紫心甘薯種質(zhì)資源，一共23份（見表1）。

表1 23份貴州紫心甘薯種質(zhì)資源

1.2 方 法

1.2.1 紫心甘薯基因組DNA的提取

紫心甘薯種質(zhì)資源基因組DNA的提?。?］，獲得的基因組DNA溶液的質(zhì)量可達(dá)到ISSR分子標(biāo)記要求。

1.2.2 ISSR－PCR反應(yīng)與電泳檢測

ISSR－PCR的反應(yīng)體系、擴(kuò)增參數(shù)和電泳檢測［8］。反應(yīng)體系：采用20μL體系，Taq 酶（1U／L）0.2μL，10×buffer 2μL，甲 酰 胺 （1%）1μL，dNTP（0.3mmol／L）：0.6μL，引 物（1U）2μL，DNA模板（45ng／μL）：2μL，加水補(bǔ)至20μL；擴(kuò)增參數(shù)：94℃充分變性5min，然后40個循環(huán)：94℃變性90s，50～60℃退火45s，72℃延伸7min，最后72℃延伸8min，4℃終止反應(yīng)；電泳檢測：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μL在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行，需45min左右，以DL 2 000作為標(biāo)記，電泳完后進(jìn)行照像保存，方便下一步讀取條帶。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

以瓊脂糖電泳的每條DNA帶為1個單位，有帶的賦值為1，無帶的賦值為0，應(yīng)用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)輸入，統(tǒng)計結(jié)果為0～1型的數(shù)據(jù)，然后利用DPS統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫心甘薯種質(zhì)資源的ISSR結(jié)果

通過從15個ISSR引物中最終篩選出7個多態(tài)性好且條帶清晰的ISSR引物［9］。利用篩選出的7個引物一共擴(kuò)增出45個條帶，每個引物平均擴(kuò)增出6.5個條帶，其多態(tài)性帶為41個，多態(tài)性百分?jǐn)?shù)達(dá)到91.1%。其中，引物825、835和引物841對23份貴州紫心甘薯種質(zhì)的ISSR－PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1～圖3。

2.2 ISSR聚類分析

通過DPS統(tǒng)計軟件對23份貴州紫心甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行了聚類分析，所獲得的聚類圖結(jié)果見圖4。

23份貴州紫心甘薯種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)范圍為0.07～0.62，平均值為0.32，表明23份貴州紫心甘薯種質(zhì)資源的親緣關(guān)系比較接近，黔紫薯1號和13－4－1的最大，為0.62；13－32－36和13－27－5的最小，為0.07。

由圖4可知，ISSR分子標(biāo)記產(chǎn)生的聚類圖將23份貴州紫心甘薯種質(zhì)資源分為5大類群，第1類為13－4－1、13－24－2、13－26－3、13－27－6、13－27－1、13－4－2、13－19－3、13－24－2、13－27－5、13－32－36、13－34－15、13－34－22、徐紫1號和徐紫糯共15份；第2類為13－24－1、13－27－2、濟(jì) 薯 18 和 13－32－38 等 共 4 份；第 3 類 為13－35－16和寧紫薯1號共2份；13－32－35和黔紫薯1號分別為第4類和第5類，都只有1份。

圖1 23份貴州紫心甘薯種質(zhì)資源的擴(kuò)增結(jié)果（引物：825）

圖2 23份貴州紫心甘薯種質(zhì)資源的擴(kuò)增結(jié)果（引物：835）

圖3 23份貴州紫心甘薯種質(zhì)資源的擴(kuò)增結(jié)果（引物：841）

其 中 13－4－1 與 13－24－1、13－32－35、13－35－16、福薯9號和黔紫薯1號的歐式距離達(dá)0.4以上，最高達(dá)0.62。在今后貴州省紫心甘薯新品種選育工作中，應(yīng)引進(jìn)一些遺傳相似系數(shù)較大即親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的紫心甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行親本組配，可選育出性狀優(yōu)異的雜交后代。

3 討 論

ISSR分子標(biāo)記具有不受取材、時間及人為限制等優(yōu)點(diǎn)，這是傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記無法相比的。李強(qiáng)等研究表明，利用ISSR分子標(biāo)記采用17個引物分析62份甘薯親本材料的遺傳多樣性，一共檢測出490條多態(tài)性的條帶，表明ISSR分子標(biāo)記是甘薯遺傳多樣性分析的可行有效的手段［10］。賀學(xué)勤等研究表明，RAPD、ISSR和AFLP這3種分子標(biāo)記都可明晰甘薯品種間的親緣關(guān)系，但I(xiàn)SSR分子標(biāo)記的聚類分析圖與系譜圖最相近，所以ISSR分子標(biāo)記更合適用于甘薯品種親緣關(guān)系的分析［11］。本研究結(jié)果與前人的基本一致，說明ISSR分子標(biāo)記的穩(wěn)定性較好，多態(tài)性高，達(dá)到91.1%，最后通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，出現(xiàn)的條帶也是較豐富的。

國內(nèi)紫心甘薯種質(zhì)資源數(shù)量有限，本實(shí)驗(yàn)僅對23份貴州紫心甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR分析。結(jié)果表明，15個ISSR引物中最終篩選出7個多態(tài)性好且條帶清晰的ISSR引物，這些篩選出的引物最終共擴(kuò)增出45個條帶，每個引物平均擴(kuò)增出6.5個條帶，其多態(tài)性帶為41個，多態(tài)性百分?jǐn)?shù)達(dá)到91.1%。ISSR分子標(biāo)記產(chǎn)生的聚類圖將23份紫心甘薯品種分為5大類群，遺傳相似系數(shù)范圍為0.07～0.62，均值為0.32，表明23份貴州紫心甘薯種質(zhì)資源的親緣關(guān)系比較接近，黔紫薯1號和13－4－1的最大，為0.62；13－32－36和13－27－5的最小，為0.07。 第 1 類 為 13－4－1、13－24－2、13－26－3、13－27－6、13－27－1、13－4－2、13－19－3、13－24－2、13－27－5、13－32－36、13－34－15、13－34－22、徐紫1號和徐紫糯共計15份；第2類為13－24－1、13－27－2、濟(jì)薯18和13－32－38等4份；第3類為13－35－16和寧紫薯1號等2份；13－32－35和黔紫薯1號分別為第4類和第5類，都只有1份。

ISSR分子標(biāo)記聚類分析把23份貴州紫心甘薯種質(zhì)資源分為不同的群別，較好地明晰了23份貴州紫心甘薯種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，在今后貴州省紫心甘薯新品種選育工作中，應(yīng)引進(jìn)一些遺傳相似系數(shù)較大即親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的紫心甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行親本組配，可選育出性狀優(yōu)異的雜交后代。

圖4 23份貴州紫心甘薯種質(zhì)資源的ISSR聚類分析

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