鄭南 謝寧 張佩青 高麗娟

[摘要] 目的 探討御唐丸對(duì)糖尿病大鼠胰腺組織胰島素受體底物-1（IRS-1）基因表達(dá)和蛋白磷酸化的影響。 方法 將150只SD大鼠按體重分層隨機(jī)分為空白組（20只）及造模組（130只）。用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)造模組大鼠10周制備2型糖尿病大鼠模型，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、糖尿樂(lè)組、御唐丸高劑量組、御唐丸低劑量組及格華止組，每組20只。按大鼠與成人等效劑量折算，御唐丸高劑量組給予御唐丸2.70 g/（kg·d），御唐丸低劑量組給予御唐丸1.35 g/（kg·d），糖尿樂(lè)組給予糖尿樂(lè)2.43 g/（kg·d），格華止組給予格華止0.09 g/（kg·d），模型組及空白組給予生理鹽水2 mL/d。連續(xù)灌胃給藥8周后取大鼠胰腺組織，用Real-time PCR方法檢測(cè)IRS-1 mRNA表達(dá)水平，用Western blot法檢測(cè)IRS-1蛋白表達(dá)及磷酸化水平。 結(jié)果 與模型組比較，格華止組、糖尿樂(lè)組、御唐丸低劑量組及御唐丸高劑量組IRS-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均有所增加（P < 0.05或P < 0.01），且御唐丸高劑量組IRS-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于御唐丸低劑量組（P < 0.05）；與模型組比較，格華止組、糖尿樂(lè)組、御唐丸低劑量組及御唐丸高劑量組IRS-1 ser307蛋白磷酸化水平均顯著降低（P < 0.01），且御唐丸高劑量組IRS-1 ser307蛋白磷酸化水平顯著低于御唐丸低劑量組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 御唐丸能通過(guò)影響IRS-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量、抑制IRS-1 ser307蛋白磷酸化進(jìn)程從而減輕胰島素抵抗，進(jìn)而對(duì)2型糖尿病起到治療作用。

[關(guān)鍵詞] 2型糖尿??；健脾益腎；養(yǎng)氣補(bǔ)陰；胰島素受體底物-1

[中圖分類(lèi)號(hào)] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）10（c）-0011-05

[Abstract] Objective To study the effects of Yutang Pills on gene expression of insulin receptor substrate-1 （IRS-1） and protein phosphorylation in pancreatic tissue of diabetic rats. Methods In this study， 150 SD rats were randomly divided into two groups according to their weight， with 20 rats in the blank group and 130 rats in the model group. The model group was fed with high fat forage for 10 weeks to prepare type 2 diabetic rat models and then divided into model control group， Tangniaole group， high dosage of Yutang Pills group， low dosage of Yutang Pills group and Glucophage group according to random number table method， with 20 rats in each group. With the equivalent dosage of rats and adults， the high dosage of Yutang Pills group was given 2.70 g/（kg·d） of Yutang Pills， low dosage of Yutang Pills group was given 1.35 g/（kg·d） of Yutang Pills， Tangniaole group was given 2.43 g/（kg·d） of Tangniaole， and Glucophage group was given 0.09 g/（kg·d） of Glucophage， meanwhile， the model control group and the blank group were given 2 mL/d of normal saline. The pancreatic tissues of rats were taken after 8 weeks of continuous intragastric administration， IRS-1 mRNA expression level was detected by Real-time PCR， and IRS-1 protein expression and phosphorylation levels were detected by Western blot. Results Compared with the model control group， the relative expression of IRS-1 mRNA in Glucophage group， Tangniaole group， low dosage of Yutang Pills group and high dosage of Yutang Pills group was increased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the relative expression of IRS-1 mRNA in high dosage of Yutang Pills group was higher than that in low dosage of Yutang Pills group （P < 0.05）. Compared with the model control group， the levels of IRS-1 ser307 protein phosphorylation in Glucophage group， Tangniaole group， low dosage of Yutang Pills group and high dosage of Yutang Pills group were significantly decreased （P < 0.01）， and the level of IRS-1 ser307 protein phosphorylation in high dosage of Yutang Pills group was lower than that in low dosage of Yutang Pills group， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Yutang Pills can play a therapeutic role in type 2 diabetes mellitus by affecting the relative expression of IRS-1 mRNA and inhibiting the progress of ser307 protein phosphorylation on IRS-1 to reduce insulin resistance.

[Key words] Type 2 diabetes mellitus； Strengthening spleen and supplementing kidney； Supplementing qi and nourishing yin； Insulin receptor substrate-1

糖尿病（DM）是在遺傳因素和環(huán)境因素長(zhǎng)期相互作用下導(dǎo)致的一種慢性、全身性、代謝性疾病，對(duì)人類(lèi)健康的危害很大。DM的分型絕大多數(shù)為2型DM（T2DM），占總數(shù)的95%左右[1]。西醫(yī)研制的胰島素增敏劑、α-糖苷酶抑制劑、雙胍類(lèi)及磺脲類(lèi)等降糖藥雖療效肯定，但普遍存在抗藥性、胃腸道反應(yīng)及肝腎毒性等副作用。中醫(yī)藥對(duì)于DM的發(fā)病機(jī)制和防治有著自己獨(dú)到的見(jiàn)解，其持久有效、副作用小的臨床效果已受到廣大DM患者的普遍認(rèn)可[2-5]?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者通過(guò)探索研究，相繼提出了脾胃虧虛、精氣不足、肝腎郁結(jié)等DM致病理論，為DM的中醫(yī)治療和預(yù)防指出了新的方向[6-9]。御唐丸是謝寧教授以民間驗(yàn)方為基礎(chǔ)，針對(duì)T2DM中醫(yī)病機(jī)特點(diǎn)，結(jié)合歷代名醫(yī)治療消渴病的寶貴經(jīng)驗(yàn)和大量的珍貴文獻(xiàn)，遵循健脾補(bǔ)腎、益氣養(yǎng)陰法擬定而成的純中藥復(fù)方制劑。大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)御唐丸具有良好的降血糖和改善胰島素抵抗的作用。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討御唐丸是否能通過(guò)對(duì)胰島素受體底物-1（IRS-1）基因表達(dá)和蛋白磷酸化的影響來(lái)治療T2DM。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠150只，8周齡，體重（180±20）g，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（黑）2017-012。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

御唐丸由西洋參、山藥、麥冬、葛根、黃芪、白芍、玉竹、山萸肉、烏梅、龜板、鹿茸、女貞子等組成，黑龍江省中西醫(yī)結(jié)合研究所制劑室生產(chǎn)（批號(hào)：20170520）。

糖尿樂(lè)：每片0.31 g，鄭州韓都藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：171103-2）。

格華止：鹽酸二甲雙胍片，每片0.85 g，中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：V4717）。

1.3 儀器與試劑

主要試劑：大鼠胰島素酶免試劑盒（FINS）（中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)：YZB，京0812-2017）；IRS-1[IRS-1（59G8）Rabbit mAb #2390，美國(guó)CST公司，批號(hào)：2017-3]；P-IRS-1 ser307[Phospho-IRS-1（Ser307）Antibody #2381，美國(guó)CST公司，批號(hào)：2017-8]。

主要儀器：F50酶標(biāo)儀（上海迪奧生物科技有限公司）；721型可見(jiàn)光分光光度計(jì)（山東高密分析儀器廠）；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SYBR Real-time PCR Universal Reagent（上海艾博思生物科技有限公司）；MX3000P Real-time PCR Instrument（美國(guó)stratagene公司）；Kodak X-Omat BT Film（Kodak中國(guó)股份有限公司）。

1.4 模型制備

150只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，造模前測(cè)定血糖，剔除血糖異常的大鼠。按照體重分層隨機(jī)分為空白組（20只）和造模組（130只）?？瞻捉M與造模組大鼠均采取自由飲食，空白組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，造模組以高脂飼料喂養(yǎng)。連續(xù)喂養(yǎng)10周后，禁食水12 h，造模組腹腔一次性注射1%鏈脲佐菌素溶液30 mg/kg，空白組腹腔注射2 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后每天尾靜脈采血測(cè)大鼠空腹血糖，持續(xù)1周以上空腹血糖維持在≥16.7 mmol/L者為T(mén)2DM成模大鼠。成功復(fù)制模型大鼠102只。

1.5 分組及給藥

選取100只成模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、糖尿樂(lè)組、御唐丸高劑量組、御唐丸低劑量組及格華止組，每組20只。未經(jīng)造模處理的20只大鼠作為空白組，各組大鼠組內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記。

按照大鼠與成人等效劑量折算，御唐丸高劑量組給予御唐丸2.70 g/（kg·d），御唐丸低劑量組給予御唐丸1.35 g/（kg·d），糖尿樂(lè)組給予糖尿樂(lè)2.43 g/（kg·d），格華止組給予格華止0.09 g/（kg·d），模型組及空白組給予生理鹽水2 mL/d。連續(xù)灌胃給藥8周后，全部處死、取樣。

1.6 標(biāo)本的采集

末次給藥后禁食水12 h，通過(guò)眼球取血獲得血樣，室溫靜置1 h后，3000 r/min 4℃離心10 min獲得血清（有效離心半徑為14 cm），送至-80℃冰箱中冷凍備用。解剖大鼠，將胰腺經(jīng)錫紙包裹后立即置于液氮，再轉(zhuǎn)至-80℃冰箱低溫凍存，用于IRS-1的PCR和Western blot檢測(cè)。

1.7 各指標(biāo)檢測(cè)方法

1.7.1 空腹血糖（FBG） 每2周周末大鼠禁食12 h后于尾靜脈取血，采用Contour TS拜安康血糖儀測(cè)定，同時(shí)記錄大鼠即時(shí)體重，比較本次血糖與前次血糖的變化。

1.7.2 空腹血清胰島素（FINS） 取定量血清，釆用酶標(biāo)儀檢測(cè)，根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.7.3 胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR） HOMA-IR=（FINS×FBG）/22.5，F(xiàn)BG的單位是mmol/L，F(xiàn)INS的單位是mmol/L。HOMA-IR不符合正態(tài)分布可取自然對(duì)數(shù)，正常值是1。由于胰島β細(xì)胞與肝臟間具有反饋環(huán)路，血清胰島素與血糖的平衡關(guān)系是合成并分泌胰島素與肝糖原分解成葡萄糖達(dá)到平衡的反映，這是HOMA的原理[10]。

1.7.4 Real-time PCR方法檢測(cè)IRS-1 mRNA表達(dá)水平 設(shè)計(jì)IRS-1的引物序列，其上游引物為5′-CGGGCTTAGGTCAGACAGC-3′，下游引物為5′-TCA-CAGCTGATGGTCTTGCTG-3′。反應(yīng)條件：95℃ 3 min，94℃ 20 s，62℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。Real-time PCR所有數(shù)據(jù)均采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.7.5 Western blot法檢測(cè)胰腺組織中IRS-1蛋白表達(dá)及磷酸化水平 組織細(xì)胞樣本中加入300 μL裂解液進(jìn)行裂解，取10 μL樣本加入10 μL 2×SDS-PAGE loading buffer混勻，100℃加熱5 min，冰上冷卻，12 000 r/min離心5 min，去除沉淀，10% SDS-PAGE分離，Semi-Dry Cell進(jìn)行半干電泳轉(zhuǎn)移，Blocking Buffer封閉轉(zhuǎn)印膜4℃過(guò)夜，37℃溫育洗滌，Super-GL ECL超敏發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，X線片曝光定影，Gel-Pro Analyzer軟件分析處理蛋白表達(dá)及磷酸化水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 17.0軟件完成。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較用方差分析，兩兩比較應(yīng)用q檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR水平比較

與空白組比較，模型組大鼠的FBG、FINS及HOMA-IR水平顯著增高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；與模型組比較，格華止組、糖尿樂(lè)組、御唐丸低劑量組及御唐丸高劑量組大鼠的FBG、FINS及HOMA-IR水平均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）；御唐丸高劑量組大鼠的FINS水平顯著低于御唐丸低劑量組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠胰腺組織IRS-1 mRNA表達(dá)水平比較

與空白組比較，模型組IRS-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；與模型組比較，格華止組、糖尿樂(lè)組、御唐丸低劑量組及御唐丸高劑量組IRS-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均有所增加（P < 0.05或P < 0.01）；御唐丸高劑量組IRS-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于御唐丸低劑量組（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠胰腺組織P-IRS-1 ser307蛋白表達(dá)水平比較

與空白組比較，模型組P-IRS-1 ser307蛋白水平顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；與模型組比較，格華止組、糖尿樂(lè)組、御唐丸低劑量組及御唐丸高劑量組大鼠胰腺組織中P-IRS-1 ser307蛋白水平均顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；御唐丸高劑量組P-IRS-1 ser307蛋白水平顯著低于御唐丸低劑量組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表3、圖1。

3 討論

DM是一種內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，其典型特征為慢性持續(xù)性的血糖濃度增高、糖耐量異常以及尿糖陽(yáng)性。人體血糖濃度增高的主要原因是機(jī)體內(nèi)胰島β細(xì)胞合成并分泌胰島素或胰島素在機(jī)體內(nèi)被利用的過(guò)程發(fā)生障礙[11]。胰島素可通過(guò)兩條途徑發(fā)揮其降血糖的功效：一是減少血糖的來(lái)源，即抑制葡萄糖生成的過(guò)程，減少氨基酸、乳酸及甘油向糖原進(jìn)行轉(zhuǎn)化，減少肝糖原的分解，抑制糖原異生；二是增加血糖的去路，即促進(jìn)葡萄糖在體內(nèi)的利用，促進(jìn)肌糖原及肝糖原的合成及貯存，同時(shí)促進(jìn)葡萄糖從胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。由此可見(jiàn)，胰島素在體內(nèi)作用強(qiáng)度減弱后血糖的濃度勢(shì)必增高[12]。同時(shí)，胰島素的合成和分泌受血糖濃度的調(diào)節(jié)，長(zhǎng)期過(guò)多地?cái)z入能量將會(huì)導(dǎo)致血糖濃度持續(xù)升高，這會(huì)使胰島素的受體后存在缺陷，并且功能狀態(tài)受損，減弱胰島素在脂肪、肌肉及肝臟組織靶細(xì)胞及靶組織中發(fā)揮的功能[13]。研究表明，胰島素信號(hào)在轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中出現(xiàn)異常是導(dǎo)致胰島素抵抗出現(xiàn)的重要原因，胰島素受體以及受體后存在缺陷均可導(dǎo)致胰島素的信號(hào)在轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中出現(xiàn)異常[14]。

IRS-1廣泛分布于全身各個(gè)組織，是胰島素抵抗的候選基因，其含有的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)功能能夠促進(jìn)胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。IRS-1 mRNA的表達(dá)量降低可使胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平下降，因此，IRS-1 mRNA表達(dá)的相關(guān)缺陷可抑制蛋白質(zhì)的功能發(fā)揮，進(jìn)而造成胰島素信號(hào)在轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中出現(xiàn)異常，從而誘發(fā)T2DM發(fā)病[15]。IRS-1中含有的酪氨酸殘基在經(jīng)過(guò)磷酸化之后，IRS-1就具有錨定的功能，錨定諸多接連的分子或諸多位于下游的在結(jié)構(gòu)組成上含SH2區(qū)域的酶，從而對(duì)胰島素信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)起到介導(dǎo)的作用[16-18]。實(shí)驗(yàn)研究表明，IRS-1基因徹底斷裂的小鼠，不但在胚胎期以及出生之后均會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育緩慢的現(xiàn)象，且會(huì)出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗癥狀[19-20]。除此之外，相關(guān)研究表明，JNK信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，能夠促進(jìn)IRS-1上絲氨酸進(jìn)行磷酸化，降低胰島素受體上的酪氨酸激酶活性，進(jìn)而抑制IRS-1上的酪氨酸位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化，該反應(yīng)具有級(jí)聯(lián)性，JNK信號(hào)通路是否被激活與胰島素信號(hào)通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在體內(nèi)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)[21]。IRS-1及IR蛋白均為胰島素信號(hào)在體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要分子，因此IRS-1蛋白表達(dá)量和功能狀態(tài)在確保胰島素正常功能發(fā)揮中起到至關(guān)重要的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠的FBG明顯升高，并存在一定程度的胰島素抵抗。治療后，與模型組比較，御唐丸高劑量組、御唐丸低劑量組大鼠的FBG、FINS及HOMA-IR水平均明顯降低。同時(shí)，與模型組比較，御唐丸高劑量組、御唐丸低劑量組大鼠胰腺組織的IRS-1 mRNA表達(dá)水平明顯升高，P-IRS-1 ser307蛋白表達(dá)水平明顯下降，說(shuō)明御唐丸能夠上調(diào)IRS-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量，降低P-IRS-1 ser307表達(dá)量，提示御唐丸能夠通過(guò)促進(jìn)胰島素與其受體結(jié)合提高IRS-1 mRNA表達(dá)，抑制IRS-1上ser307磷酸化進(jìn)程，阻礙位于上游的JNK蛋白磷酸化過(guò)程，從而減輕胰島素抵抗，對(duì)T2DM起到治療作用。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)IRS-1基因的表達(dá)和蛋白磷酸化的研究，提示御唐丸能夠促進(jìn)精微物質(zhì)在體內(nèi)的消化吸收，增強(qiáng)體內(nèi)胰島素的靶細(xì)胞、靶組織對(duì)胰島素的敏感性，能夠在減少血糖的來(lái)源的同時(shí)增加血糖的去路，從而降低血糖濃度，糾正糖代謝的紊亂狀況。由此可推斷，御唐丸能夠使血糖濃度降低的機(jī)制與其抑制IRS-1上絲氨酸進(jìn)行磷酸化具有相關(guān)性。

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（收稿日期：2018-05-08 本文編輯：張瑜杰）