蘆晉+任雪+劉相良+劉澤鋒

摘要利用超高效液相色譜四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLCQOrbitrap MS）方法對宮頸癌（Cervical cancer， CC）患者和健康人（Healthy control，HC）的尿液進行分析，研究宮頸癌患者尿液中的潛在標志物，為其發(fā)病機制和診斷提供科學(xué)依據(jù)。篩選11例宮頸癌患者（Age （457± 56） years）及11例健康人 （Age （459± 32） years）尿液樣本，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對尿液進行測定，通過主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）處理數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，兩組人群代謝輪廓有顯著差別，發(fā)現(xiàn)并鑒定了12種潛在的生物標志物，提示特定的腫瘤代謝途徑中潛在的代謝標志物可能在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞宮頸癌；超高效液相色譜四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜；代謝組學(xué)；尿液；生物標志物

1引 言

宮頸癌（Cervical cancer， CC）是最常見的婦科惡性腫瘤，近年發(fā)病率有下降趨勢，死亡率也有所降低[1]，但有患病年輕化的趨勢，其發(fā)病機制與生物標志物的篩選和檢測是研究的熱點。癌變的因素主要包括病毒感染、性行為及分娩次數(shù)過多以及衛(wèi)生條件差等[2]。在臨床上早期常無明顯癥狀，部分患者因?qū)m頸外觀正常容易造成漏診或誤診，晚期可引起輸尿管梗阻、貧血等全身衰竭的癥狀[3]。目前，臨床上通過病理實驗診斷宮頸癌，用于常見的鱗癌、腺癌和腺鱗癌3種類型癌癥的鑒別及早期診斷[4]，但這種診斷技術(shù)一般會增加患者痛苦，且早期患者診斷準確率不高。

研究表明，RCAS1作為宮頸癌生物標志物具有臨床意義[5]。Ralhan等[6]使用iTRAQ標記，利用多維液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析差異蛋白表達，發(fā)現(xiàn)和驗證了宮頸癌的大分子生物標志物。 Moore等[7]對血清中腫瘤生物標志物HE4在宮頸癌患者體內(nèi)的生物學(xué)作用進行了研究。Diamandis等[8]利用激肽釋放酶，發(fā)現(xiàn)了人體腫瘤組織中一種新的癌癥生物標志物。Trivedi等[9]對宮頸癌和前列腺癌細胞系的癌癥生物標志物進行了體外評估。Chen等[10]利用RRLCMS/MS技術(shù)，結(jié)合統(tǒng)計學(xué)方法檢測了9種宮頸癌的潛在代謝標志物。關(guān)于癌癥尿液代謝組學(xué)的相關(guān)報道促進了癌癥疾病檢測和發(fā)展機制的研究進程[11，12]，然而，目前對于宮頸癌患者的尿液中小分子生物標志物的報道較少。

本研究利用超高效液相色譜四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLCQOrbitrap MS）[13～15]檢測宮頸癌患者尿液中代謝物的變化，通過主成分分析（PCA）法篩選潛在生物標志物，結(jié)合病理指標研究宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機制，為宮頸癌早期篩查和臨床治療提供了依據(jù)。

2實驗部分

21儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000 超高效液相色譜儀和四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)（美國 ThermoFisher 公司產(chǎn)品）；5804R型高速離心機（德國Eppendorf公司）；MilliQ 超純水系統(tǒng)（美國 Millipore 公司）。尿酸（HPLC 級，南京澤朗生物科技有限公司），乙腈和甲酸（HPLC 級，美國 TEDIA 試劑公司）。

22樣本來源及處理

宮頸癌患者尿樣和健康人尿樣均由吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院提供，經(jīng)過吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院機構(gòu)倫理委員會批準，所有患者都簽署了知情同意書?；颊咄ㄟ^病理實驗確診為宮頸癌，11例宮頸癌患者（Age （457± 56） years） 及11例健康人（Age （459 ± 32） years） 尿液樣品，清晨空腹收取尿樣。采集兩組人群尿液樣品，3000 r/min離心10 min，除去雜質(zhì)，于

Symbolm@@ 80℃儲存?zhèn)溆?。樣品室溫下溶解，采用離心沉降后的稀釋方法[16]，在4℃以12000 r/min離心5 min，取50 μL上清液，用水稀釋至200 μL， 渦旋混勻，經(jīng)045 μm濾膜過濾后，待測。

將所有的宮頸癌患者尿液取等量混合均勻后，按照上述樣品處理過程處理，所得作為質(zhì)量控制樣品（Quality control，QC）。將健康人的尿液混合作為參照，每個樣品重復(fù)測定3次。

23色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱： Thermo Syncronis C18色譜柱 （100 mm × 3 mm， 17 μm），流動相A為01% 甲酸溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫程序： 0～5 min， 10%～30% B； 5～10 min， 30%～80% B； 10～12 min， 80%～85% B； 12～14 min， 85%～95% B； 14～16 min， 95% B； 16～ 17 min， 95%～100% B。柱溫30℃；流速02 mL/min；進樣量5 μL。采用電噴霧正、負離子掃描模式；干燥氣（N2）流量為9 L/min，溫度為350℃； 霧化電壓為40 eV；毛細管電壓為35 kV；碎裂電壓為150 V；錐孔電壓為65 V，質(zhì)量掃描范圍m/z 200～1500。

24數(shù)據(jù)處理

采用Xcalibur對UHPLCQOrbitrap MS檢測得到的數(shù)據(jù)峰校準、背景扣除、面積歸一化和數(shù)據(jù)簡化處理。將文件導(dǎo)入EZinfo 20軟件OPLSDA 進行多元變量分析。單變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用 t 檢驗（ttest），當 p < 005 被認為數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)意義。多變量數(shù)據(jù)進行主成分分析，通過PCA得分圖（Score plot）獲得樣本分類信息，通過PCA 載荷圖（Loading plot）發(fā)現(xiàn)其可作為生物標志物的化合物并予以鑒定。使用生物學(xué)數(shù)據(jù)庫HMDB （http：//www hmdb ca）、METLIN （http：//metlinscripps edu）[17]將數(shù)據(jù)可視化，尋找具有顯著特征的生物標志物。endprint

3結(jié)果與討論

31宮頸癌患者和健康人尿液LCMS總離子流圖

建立UHPLCQOrbitrap MS分析尿液樣品的方法，分別在正負離子模式下進行檢測分析。分別將所有宮頸癌患者（Cervical cancer， CC）和健康人（Heathy control， HC）的尿液取等量混合均勻后進行質(zhì)譜檢測， 總離子流圖如圖1所示。在正負離子模式下，兩組人群的尿液的總離子流圖存在明顯差別，詳細的信息進一步采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA）獲得。

32數(shù)據(jù)分析

321主成分分析采用主成分分析統(tǒng)計宮頸癌組和健康組尿樣中的代謝物的變化趨勢。如圖2所示，正離子模式下的PCA 得分圖能夠很好地區(qū)分二者。圖2中每個點代表一個樣品，每個樣品的位置由其成分決定，處于相同生理病理狀態(tài)的樣本通常具有相似的代謝物組成，因此在得分圖上也處于相似的位置。相反，彼此之間距離越遠，表示其生理病理的狀態(tài)相差越大。其中，得分圖中代表患病組的點較為分散，通過每個點所對應(yīng)的患者病例二次核查，推斷可能是患者治愈期或者類型不同所致。

322差量變異研究基于宮頸癌患者組和健康組的PCA分析結(jié)果，確定兩組尿液間存在代謝差異。圖3為兩組樣品OPLSDA得分圖和正負離子模式下的Splot 載荷圖，圖中每個點代表樣品中代謝物相關(guān)信息，距離原點越遠的點對兩組間區(qū)分貢獻越大，為兩組中差異較大的代謝物。

323潛在生物標志物的鑒定根據(jù)精確分子量和 MS/MS 結(jié)果以及與 HMDB、METLIN 數(shù)據(jù)庫或標準品進行比較，鑒定尿液中宮頸癌潛在的生物標志物。以m/z 1670184 為例，在負離子模式下，該化合物的提取離子流圖和在保留時間 1365 min 時的組分質(zhì)譜圖如圖5A和5B 所示。將結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中化合物進行比對，初步確定該化合物為尿酸。串聯(lián)質(zhì)譜的結(jié)果（圖5C）也證實了這一點，與尿酸標準品的串聯(lián)質(zhì)譜離子碎片質(zhì)荷比結(jié)果比對，兩者完全一致。根據(jù)以上信息，確定其為尿酸。其它化合物采用同樣方法鑒定，但仍有一些化合物不能完全鑒定，需要進一步研究。表1列出了潛在生物標志物的鑒定結(jié)果。通過分析軟件給出了潛在標志物在HC組和CC組之間的變化趨勢，標志物的增加或者減少反映了代謝通路的進行方向與趨勢。

33代謝通路分析

通過UHPLCMS 方法對宮頸癌患者和健康人尿液進行檢測，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)計算發(fā)現(xiàn)17種潛在生物標志物及變化趨勢，并鑒定出尿酸等12種化合物可能與宮頸癌腫瘤的發(fā)病機制和代謝途徑有關(guān)。在體內(nèi)，嘌呤是核酸的代謝產(chǎn)物，而尿酸是嘌呤的代謝最終產(chǎn)物，因此尿酸是細胞分解的最終產(chǎn)物之一，尿酸測定在宮頸癌并抗利尿激素分泌異常綜合征中有重要意義，代謝紊亂也可導(dǎo)致尿酸增高。近年來一些研究表明，尿酸含量變化揭示宮頸癌發(fā)展的過程，而血尿酸濃度與宮頸癌發(fā)展程度密切相關(guān)，是炎癥類疾病的危險因素[18]。尿酸是谷氨酸轉(zhuǎn)化組氨酸的中間體。尿酸下調(diào)可能與腫瘤組織或谷氨酸代謝紊亂的組氨酸代謝障礙有關(guān)[19]。Ogihara等[20]的研究表明，尿酸及其氧化產(chǎn)物可以作為體內(nèi)自由基生成的標志。

甜菜堿可提供3個不穩(wěn)定的甲基，是多種物質(zhì)合成的原料，如肉堿、肌酸和嘌呤等；同時，通過去甲基作用生成甘氨酸，進入氨基酸代謝循環(huán)。由于甜菜堿可提供甲基和氨基酸，可參與機體氨基酸代謝、脂肪代謝及DNA 甲基化等過程[21]。尿液中甜菜堿的濃度較低時，可引發(fā)脂類代謝紊亂及相關(guān)炎癥。甘露醇和氨基馬尿酸在尿液中的含量變化也是反映機體炎癥的代謝標志物[22]。以上檢測到的代謝產(chǎn)物可能是宮頸癌發(fā)病的獨立危險因子。

1甲基鳥嘌呤、尿素和茶堿是嘌呤的衍生物。細胞外核苷酸可以通過不同亞型的P2受體調(diào)節(jié)癌細胞增殖、分化和凋亡，其中P2X7 受體導(dǎo)致細胞凋亡從而數(shù)量減少[23]。宮頸癌組織和正常組織相比，P2X7 受體水平較低，可能導(dǎo)致嘌呤代謝產(chǎn)物濃度變化[24]。

4結(jié) 論

將UHPLCQOrbitrap MS與PCA 等統(tǒng)計方法相結(jié)合，分別對11名宮頸癌患者與健康人的尿液進行快速分析。發(fā)現(xiàn)并鑒定出12種宮頸癌的潛在生物標志物，揭示了核酸代謝及氨基酸代謝在宮頸癌發(fā)病的變化，對于臨床上宮頸癌的早期診斷、預(yù)防及治療惡性腫瘤提供了重要參考。

References

1Lee K D， Chen C Y， Huang H J， Wang T Y， Teng D， Huang S H， Lai C H， Chen M C BMC Cancer， 2015， 15： 393

2Bouros D， Papadakis K， Siafakas N， Fuller A F Cancer， 2015， 78（3）： 441-447

3Nebgen D R， Hartman C L， Rhodes H， Munsell M， Woodard T， Lu K Obstetrics Gynecol， 2014， 123 ： 30S

4Kang S， Kim J W， Kang GH， Lee S， Park N H， Song Y S， Park S Y， Kang S B， Lee H P Int J Cancer， 2006， 118（9）： 2168-2171

5Sonoda K， Miyamoto S， Hirakawa T， Yagia H， Yotsumoto F， Nakashima M， Watanabe T， Nakano H Gynecol Oncol， 2006， 103（3）： 924-931

6Ralhan R， DeSouza L V， Matta A， Tripathi S C， Ghanny S， Gupta S D， Bahadur S， Michael Siu K W Mol Cell Proteomics， 2008， 7（6）： 1162-1173endprint

7Moore R G， Brown A K， Miller MC， Badgwell D， Lu Z， Allard W J， GranaiC O， Bast R C， Lu K Gynecol Oncol， 2008， 110（2）： 196-201

8Diamandis E P， Yousef G M Clin Chem， 2002， 48（8）： 1198-1205

9Trivedi M K， Patil S， Shettigar H， Gangwar M， Jana S Cancer Sci Therapy， 2015， 7（8）： 253-257

10Chen Y， Xu J， Zhang R， Shen G， Song Y， Sun J， He J， Zhan Q， Abliz Z Analyst， 2013， 138（9）： 2669-2677

11WANG GuiMing， SHI DongDong， PENG ZhangXiao， LU YangFang， GU Xue， WANG Yan， YAN Chao Chinese J Anal Chem， 2015， 43（5）： 682-688

王桂明， 史棟棟， 彭章曉， 魯陽芳， 谷 雪， 王 彥， 閆 超 分析化學(xué)， 2015， 43（5）： 682-688

12LINYunJing， WANG Jin， WANG Yi， QU HaiBin， CHENG YiYu Chinese J Anal Chem， 2008， 36（9）： 1257-1260

林云徑， 汪 晉， 王 毅， 瞿海斌， 程翼宇 分析化學(xué)， 2008， 36（9）： 1257-1260

13WANG XiaoFei， JIANG ShouFang， ZHANG WeiBing， ZHANG LingYi， Liu Ying， DU XiaoYan， Zhang Jie， SHEN HeQing Chinese J Anal Chem， 2017， 45（5）： 633-640

王曉飛， 蔣守芳， 張維冰， 張凌怡， 劉 穎， 杜曉妍， 張 潔， 申河清 分析化學(xué)， 2017， 45（5）： 633-640

14LU WeiQin， TONG Ling， LI DongXiang， XU FengGuo Chinese J Anal Chem， 2017， 45（6）： 791-798

蘆勤瑋， 佟 玲， 李東翔， 許風(fēng)國 分析化學(xué)， 2017， 45（6）： 791-798

15CHEN ShengLan， ZHAO XiaoYan， REN LuJing， JI XiaoJun， HUANG He Chinese J Anal Chem， 2016， 44（5）： 685-692

陳勝蘭， 趙曉艷， 任路靜， 紀曉俊， 黃 和 分析化學(xué)， 2016， 44（5）： 685-692

16CHEN YanHua， ZHANG RuiPing， SONG YongMei， Dong LiJia， ZHAN QiMin， ZAIPAER·Abulizi Chinese J Anal Chem， 2011， 39（2）： 173-177

陳艷華， 張瑞萍， 宋詠梅， 董立佳， 詹啟敏， 再帕爾·阿不力孜 分析化學(xué)， 2011， 39（2）： 173-177

17Niu J， Pi Z F， Yue H， Yang H M， Wang Y， Yu Q， Liu SY Rapid Commun Mass Spectrom， 2012， 26（23）： 2683-2689

18Hiatt R A， Fireman B H Cancer Res， 1988， 48（10）： 2916-2918

19Koizumi H， Shimizu T， Nishino H， Ohkawara A Arch Dermatol Res， 1998， 290（5）： 264-269

20Ogihara T， Kim H S， Hirano K， Imanishi M， Ogihara H， Tamai H， Okamoto R， Mino M Biol Neonate， 1998， 73（1）： 24-33

21LI Fei， YAO JunHu Feed industry， 2009， 30（20）： 47-50

李 飛， 姚軍虎 飼料工業(yè)， 2009， 30（20）： 47-50

22Schicho R， Shaykhutdinov R， Ngo J， Nazyrova A， Schneider C， Panaccione R， Kaplan G G， Vogel H J， Storr M J Proteome Res， 2012， 11（6）： 3344-3357

23White N， Burnstock N Trends Pharmacol Sci， 2006， 27（4）： 211-217

24Li X， Zhou L， Feng Y H， AbdulKarim F W， Gorodeski G I Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2006， 15（10）： 1906-1913

AbstractThis work aims to analyze and compare the potential biomarkers between cervical cancer （CC） patients and healthy controls （HC） The urine samples of 11 CC patients （age （4565 ± 56） years） and 11 HC patients （age （459 ± 32） years） were collected The metabolites of urine samples from CC and HC were analyzed by using ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole orbitrap tandem mass spectrometry （UHPLCQOrbitrap MS/MS）， which could provide evidence for early diagnose and disease pathway The LCMS data of urines were analyzed by principal components analysis （PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLSDA） to identify the potential biomarkers Urine samples of CC patients were successfully discirminated from those of healthy controls A total of twelve significant metabolites were found and identified as potential biomarkers according to the established UHPLCQOrbitrap MS and MS/MS method Identification of biomarkers between CC and HC patients may play an important role in the study of mechanism of UC and its pathway

KeywordsCervical cancer； Ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole orbitrap tandem mass spectrometry； Metabonomics； Urine； Biomarkersendprint