劉 欣，朱健樹(shù)，劉楊洋，黃玉蕓，李子洋，許滋楊，韓玉成(.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，長(zhǎng)春 3002；2.吉林省石化資源與生物質(zhì)綜合利用工程實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 3002)

近年來(lái)，能源危機(jī)和環(huán)境污染已成為全人類面臨的重大課題，其中石油供需矛盾尤為突出，研究新的可替代能源迫在眉睫[1]。生物柴油是新能源的一種，燃燒性能好，含硫量低，可代替化石燃料，且環(huán)?？稍偕鶾2]。目前生產(chǎn)生物柴油的主要原料為動(dòng)植物油脂等可再生資源，但利用動(dòng)植物油脂為原料成本高，其成本占到總生產(chǎn)成本的70%～85%，且受場(chǎng)地、季節(jié)、氣候的影響較大，經(jīng)濟(jì)可行性差，制約了生物柴油的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

微生物油脂又稱單細(xì)胞油脂[3]，是指由酵母、霉菌、細(xì)菌和藻類等微生物在一定條件下，利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭鳛樘荚?，在菌體內(nèi)產(chǎn)生的大量油脂[4]。微生物油脂具有發(fā)酵周期短，來(lái)源比較廣泛，不受季節(jié)、場(chǎng)地、環(huán)境變化影響等優(yōu)點(diǎn)，是生物柴油產(chǎn)業(yè)和生物經(jīng)濟(jì)的重要研究方向。其中酵母菌在油脂發(fā)酵過(guò)程中能積累較大的生物量，且原料來(lái)源廣泛，受到科研工作者的極大關(guān)注。擲孢酵母(Sporobolomycesreseus)是傳統(tǒng)的油脂生產(chǎn)菌，其質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)工業(yè)發(fā)酵至關(guān)重要。誘變是改良菌種的基本方法，但單獨(dú)使用一種誘變方法，誘變效率低，且易發(fā)生回復(fù)突變，因而通常采用物理化學(xué)復(fù)合誘變的方法改良菌種。目前，在其他酵母體系中采用的有效復(fù)合誘變方法是紫外(UV)與亞硝基胍(NTG)復(fù)合誘變和紫外(UV)與硫酸二乙酯(DES)復(fù)合誘變[5-6]?；诖耍狙芯坎捎靡陨蟽煞N復(fù)合誘變方式對(duì)原始菌株擲孢酵母As.2.618進(jìn)行誘變育種，以篩選高產(chǎn)油脂突變株，進(jìn)一步提高油脂產(chǎn)量及低溫流動(dòng)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

擲孢酵母(Sporobolomycesreseus)As.2.618，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

葡萄糖，酵母浸膏粉，瓊脂粉，蛋白胨，MgSO4·7H2O，KH2PO4，(NH4)2SO4，無(wú)水乙醇，氯化鈉，正己烷，石油醚，甲醇，二甲基亞砜，DES，NTG，淺藍(lán)菌素(Cerulenin)，馬來(lái)酰肼。

淺藍(lán)菌素母液(2.24×10-3mol/L)：5 mg淺藍(lán)菌素充分溶解于10 mL二甲基亞砜中。母液經(jīng)過(guò)0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌備用。

2% DES溶液：取0.4 mL DES用少量乙醇溶解，再加2 mol/L pH 7.2的磷酸緩沖液，定容至20 mL。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：14%麥芽汁斜面培養(yǎng)基，pH 6.0～6.5，121℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母膏0.5 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，KH2PO41 g/L，(NH4)2SO45 g/L，pH 6.0～6.5，121℃滅菌30 min。

發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基：葡萄糖103 g/L，酵母膏11.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.15 g/L，KH2PO40.1 g/L，pH 6.0～6.5，121℃滅菌30 min。

普通平板培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖10 g/L，瓊脂20 g/L，pH 6.0～6.5 g/L，121℃滅菌30 min。

淺藍(lán)菌素篩選平板培養(yǎng)基：普通平板培養(yǎng)基(1 L)滅菌后降溫至50℃，分別向其中加入20、40、60、80、100、120、140、160 μL的淺藍(lán)菌素母液制成篩選平板培養(yǎng)基后倒平板。

馬來(lái)酰肼篩選平板培養(yǎng)基：向普通平板培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的馬來(lái)酰肼至終質(zhì)量濃度分別為1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 g/L。超聲溶解，滅菌后倒平板。

1.1.4 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)，紫外分光光度計(jì)，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋，高壓蒸汽鍋，離心機(jī)，顯微鏡，電子分析天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化與發(fā)酵培養(yǎng)

菌種活化：將擲孢酵母As.2.618接于斜面培養(yǎng)基上26℃培養(yǎng)96 h。

種子擴(kuò)大培養(yǎng)：將在斜面培養(yǎng)基上活化后的菌種接1環(huán)到液體種子培養(yǎng)液中，250 mL三角瓶裝液量為50 mL，培養(yǎng)條件為26℃，180 r/min，活化48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)48 h后的種子液以10%的接種量接于發(fā)酵搖瓶進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)脂。向裝液量為250 mL 三角瓶中裝入50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度26℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)120 h。

1.2.2 菌種選育

1.2.2.1 UV-NTG復(fù)合誘變及馬來(lái)酰肼篩選

紫外誘變：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體用無(wú)菌水配制成108個(gè)/mL菌懸液，置于功率15 W的紫外燈20 cm 處，磁力攪拌。紫外照射時(shí)間分別為10、20、30、40、50 s，以不同照射時(shí)間獲得不同誘變劑量[7]。誘變完畢后，在紅光下分別取0.10 mL的菌液進(jìn)行平板涂布，26℃避光培養(yǎng)48 h后以未誘變菌液為對(duì)照，計(jì)算并繪制致死率曲線。選取致死率為70%～80%的紫外照射時(shí)間為最佳紫外誘變劑量。致死率=(對(duì)照組菌落數(shù)-誘變后菌落數(shù))/對(duì)照組菌落數(shù)×100%。

NTG誘變：將經(jīng)紫外誘變選育的突變株進(jìn)行活化，用無(wú)菌水稀釋至108個(gè)/mL。以不同質(zhì)量濃度NTG獲得不同誘變劑量[8]，向菌懸液中添加NTG至終質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L。振蕩處理30 min后，將其涂布于普通平板培養(yǎng)基，26℃恒溫培養(yǎng)48 h，以未經(jīng)誘變處理的菌液平板菌落作對(duì)照，計(jì)算致死率并繪制NTG致死率曲線。選取致死率為70%～80%的NTG終質(zhì)量濃度作為最佳誘變劑量。

馬來(lái)酰肼初篩：經(jīng)UV-NTG復(fù)合誘變后，挑取菌落較大且菌落形態(tài)與原始菌株的菌落形態(tài)有明顯不同的突變株活化，配制成108個(gè)/mL的菌懸液，分別取0.10 mL菌液涂布于1.1.3所示的不同終質(zhì)量濃度的馬來(lái)酰肼篩選平板中，以未添加抑制劑的平板作對(duì)照，26℃恒溫培養(yǎng)48 h，計(jì)算存活率[9]并繪制馬來(lái)酰肼存活率曲線。存活率=誘變后菌落數(shù)/對(duì)照組菌落數(shù)×100%。

1.2.2.2 UV-DES復(fù)合誘變及淺藍(lán)菌素篩選

紫外誘變：采用1.2.2.1中所述最佳紫外誘變條件對(duì)原始菌株進(jìn)行誘變，選育長(zhǎng)勢(shì)較好的突變株。

DES誘變：將上述突變株活化后稀釋至108個(gè)/mL，分別取50 mL菌懸液，加入1.2 mL 2%DES溶液，以不同的DES處理時(shí)間獲得不同誘變劑量，振蕩處理40、60、80、100、120 min后[5]，加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。取0.10 mL誘變后菌液均勻涂布于普通平板培養(yǎng)基，26℃恒溫培養(yǎng)48 h后，計(jì)算并繪制DES致死率曲線。選取致死率為70%～80%的DES振蕩時(shí)間作為最佳誘變劑量。

淺藍(lán)菌素初篩：將UV-DES復(fù)合誘變選育出的突變株于淺藍(lán)菌素篩選平板上篩選，方法同1.2.2.1中馬來(lái)酰肼初篩。

1.2.2.3 突變株復(fù)篩及遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

復(fù)篩：分別從兩種初篩平板中各挑選5株長(zhǎng)勢(shì)較好的突變株，移至搖瓶進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量3個(gè)指標(biāo)判斷菌株的誘變效果。

傳代：將上述油脂產(chǎn)量最高的突變株連續(xù)5次傳代培養(yǎng)后測(cè)定其生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量，并比較前后數(shù)值的變化。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 生物量的測(cè)定

發(fā)酵液于7 000 r/min下離心5 min后，傾去上清液，沉淀(菌體)用蒸餾水離心清洗2次，轉(zhuǎn)入已經(jīng)稱量好的稱量皿中，于90～100℃烘至恒重(含水量在4%以下)。生物量=干菌體質(zhì)量/發(fā)酵液體積。

1.2.3.2 油脂的提取測(cè)定

采用酸熱法提取油脂[10]。

油脂產(chǎn)量=油脂質(zhì)量/發(fā)酵液體積

油脂含量=油脂產(chǎn)量/生物量×100%

1.2.3.3 油脂脂肪酸分析

參照文獻(xiàn)[11]對(duì)油脂進(jìn)行甲酯化，采用氣相色譜進(jìn)行脂肪酸組分分析。氣相色譜條件：GC6890N氣相色譜儀，DB-23色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，F(xiàn)ID檢測(cè)器，溫度250℃；載氣為氮?dú)?，流?0 mL/min，氫氣流速40 mL/min，空氣流速350 mL/min；進(jìn)樣模式為分流進(jìn)樣，分流比30∶1；進(jìn)樣口溫度250℃；進(jìn)樣量1.0 μL；程序升溫為初溫120℃，保持2 min，以4℃/min升溫至200℃，保持22 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV-NTG復(fù)合誘變及馬來(lái)酰肼篩選

2.1.1 紫外誘變劑量的確定

按1.2.2.1采用不同的紫外照射時(shí)間對(duì)原始菌株進(jìn)行處理，以未經(jīng)照射的菌株作為對(duì)照，通過(guò)平板活菌計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)照射后的活細(xì)胞含量，計(jì)算致死率。以紫外照射時(shí)間為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)繪制致死率曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 紫外照射時(shí)間對(duì)致死率的影響

由圖1可知，紫外照射時(shí)間對(duì)菌株致死率影響較大。在開(kāi)始的20 s內(nèi)，隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率顯著提升，此時(shí)致死率為69.48%；但 40 s 后致死率變化減緩，照射40 s和50 s時(shí)，致死率分別為84.08%和86.47%。較高的誘變指標(biāo)(致死率)有利于篩選優(yōu)良菌株，但如果紫外照射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則不利于篩選。因此，選擇70%～80%為目的致死率作為誘變劑量[12]。選擇紫外照射30 s為原始菌株的紫外誘變劑量，此條件下致死率為76.48%。

2.1.2 NTG誘變劑量的確定

NTG是有效的化學(xué)誘變劑，可以使DNA分子上的堿基及磷酸部分烷化，導(dǎo)致DNA復(fù)制時(shí)堿基配對(duì)錯(cuò)誤而引起突變[13]。菌株菌懸液經(jīng)不同終質(zhì)量濃度的NTG誘變后致死率見(jiàn)圖2。

圖2 NTG終質(zhì)量濃度對(duì)致死率的影響

由圖2可知，隨著NTG終質(zhì)量濃度的增加，致死率逐漸升高。選取致死率70%～80%作為最佳誘變劑量，當(dāng)NTG終質(zhì)量濃度為0.08 g/L時(shí)，致死率為78.43%，在目標(biāo)致死范圍之內(nèi)。繼續(xù)提高NTG終質(zhì)量濃度，菌體致死率迅速提高，當(dāng)NTG終質(zhì)量濃度達(dá)到0.10 g/L時(shí)，致死率為92.16%，菌體接近死亡。因此，選取0.08 g/L為NTG最佳誘變劑量。

2.1.3 馬來(lái)酰肼篩選

生物柴油中的油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸是經(jīng)一系列脂肪酸脫氫酶脫飽和而產(chǎn)生的，其活性受到馬來(lái)酰肼的抑制，使其不能合成正常生理活動(dòng)所必需的脂肪酸，從而抑制菌株的生長(zhǎng)[14]。經(jīng)馬來(lái)酰肼篩選后菌落存活率曲線見(jiàn)圖3。

圖3 馬來(lái)酰肼處理下擲孢酵母的菌落存活率

由圖3可知，隨著馬來(lái)酰肼終質(zhì)量濃度的提高，原始菌株存活率逐漸下降。當(dāng)馬來(lái)酰肼終質(zhì)量濃度達(dá)到2.2 g/L時(shí)，菌落存活率僅為12.50%，因此選擇2.2 g/L的馬來(lái)酰肼作為篩選劑加入平板培養(yǎng)中，初步淘汰脂肪酸脫氫酶酶活較低、不足以維持菌株正常生長(zhǎng)的突變株。

2.1.4 突變株復(fù)篩結(jié)果

從馬來(lái)酰肼初篩平板中挑選5株長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落進(jìn)行復(fù)篩測(cè)定生物量、油脂含量及油脂產(chǎn)量，5株菌株分別命名為UV-NTG-1，UV-NTG-2，UV-NTG-3，UV-NTG-4，UV-NTG-5，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，UV-NTG-2號(hào)菌株的生物量、油脂含量及油脂產(chǎn)量最大，分別為39.01 g/L、19.83%、7.74 g/L，較原始菌株分別提高了42.42%、52.30%、116.81%，因此選取該菌株作為UV-NTG復(fù)合誘變的最佳菌株，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，確定其遺傳穩(wěn)定性。

表1 UV-NTG復(fù)合誘變突變株發(fā)酵結(jié)果

2.2 UV-DES復(fù)合誘變及淺藍(lán)菌素篩選

2.2.1 DES振蕩時(shí)間的確定

DES能使DNA烷基化，從而引起DNA復(fù)制時(shí)的轉(zhuǎn)換或顛倒而使物種突變或死亡。不同生物對(duì)DES的敏感程度不同，因此復(fù)合誘變前需確定菌株的最佳誘變條件[15]。DES振蕩時(shí)間對(duì)菌體致死率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 DES振蕩時(shí)間對(duì)致死率的影響

由圖4可知，延長(zhǎng)DES的振蕩時(shí)間會(huì)增加菌體DNA突變的概率，從而提高致死率。當(dāng)DES振蕩時(shí)間為100 min時(shí)，致死率為70.14%，在目標(biāo)致死范圍內(nèi)。誘變時(shí)間為120 min時(shí)，致死率高達(dá)93.73%，菌體接近死亡。因此，DES振蕩時(shí)間選擇100 min。

2.2.2 淺藍(lán)菌素篩選

β-酮酯酰-ACP合酶是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，可被天然產(chǎn)物淺藍(lán)菌素進(jìn)行不可逆抑制，與其活化位點(diǎn)的半胱氨酸上的巰基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成內(nèi)酰胺環(huán)而使之失活，從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝[16-17]。因此，在含有一定濃度的淺藍(lán)菌素培養(yǎng)基上，只有脂肪酸合成酶活性較高的菌株才能存活下來(lái)而被選出。經(jīng)1.2.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定，在淺藍(lán)菌素的作用下，僅有部分平板有少量菌落存活下來(lái)，且大小不一。經(jīng)淺藍(lán)菌素篩選菌落存活率曲線見(jiàn)圖5。

由圖5可知，菌落的形成隨淺藍(lán)菌素添加量的增加而逐步減少，當(dāng)淺藍(lán)菌素的添加量達(dá)到160 μL(17.92 μmol/L)時(shí)，擲孢酵母的菌落存活率為 9.80%，故以此添加量作為篩選處理的最佳劑量。

圖5 淺藍(lán)菌素處理下擲孢酵母的菌落存活率

2.2.3 UV-DES復(fù)合誘變及淺藍(lán)菌素篩選

從2.2.2淺藍(lán)菌素篩選平板中挑選其中5株長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落進(jìn)行復(fù)篩，測(cè)定編號(hào)為UV-DES-1，UV-DES-2，UV-DES-3，UV-DES-4，UV-DES-5突變株的生物量、油脂含量及油脂產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 UV-DES復(fù)合誘變突變株發(fā)酵結(jié)果

由表2可知，UV-DES-2號(hào)菌株的生物量、油脂含量及油脂產(chǎn)量最大，分別為38.96 g/L、20.80%、8.10 g/L，較原始菌株分別提高了42.24%、59.75%、126.89%。因此，選擇UV-DES-2號(hào)菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)，考察突變株的遺傳穩(wěn)定性。從結(jié)果上看，兩種復(fù)合誘變方法都能使菌株的產(chǎn)油能力顯著提高，可以使油脂產(chǎn)量提高1倍以上，但UV-DES復(fù)合誘變方法略優(yōu)于UV-NTG復(fù)合誘變方法。

2.3 油脂脂肪酸分析(見(jiàn)表3)

表3 油脂脂肪酸組成 %

由表3可知，突變株UV-DES-2與UV-NTG-2的脂肪酸組成中，C18∶1的相對(duì)含量最高，分別為80.54%和75.35%，分別較原始菌株提高了11.88 個(gè)百分點(diǎn)和6.69個(gè)百分點(diǎn)；雖然C18∶2含量分別較原始菌株降低了6.45個(gè)百分點(diǎn)和2.04個(gè)百分點(diǎn)，但十八碳不飽和脂肪酸的總量均較原始菌株有所提高(提高了5.43個(gè)百分點(diǎn)和4.65個(gè)百分點(diǎn))；而C20∶1的相對(duì)含量均較原始菌株有所下降。在制備生物柴油時(shí)，油脂脂肪酸組成中飽和脂肪酸甲酯含量越高且長(zhǎng)鏈脂肪酸甲酯含量越多，該生物柴油的低溫流動(dòng)性越差，因此突變株油脂的流動(dòng)性較原始菌株高。

2.4 突變株的遺傳穩(wěn)定性(見(jiàn)表4)

表4 傳代后菌株的發(fā)酵結(jié)果

由表4可知，突變株UV-DES-2與UV-NTG-2連續(xù)傳至第5代的生物量與產(chǎn)油能力分別較第1代無(wú)顯著差異，說(shuō)明兩種誘變菌株具有遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

采用UV-NTG和UV-DES兩種誘變方法對(duì)擲孢酵母As.2.618進(jìn)行誘變，得出在UV-NTG復(fù)合誘變及馬來(lái)酰肼篩選方法中，紫外最佳誘變劑量為30 s，NTG誘變劑量為0.08 g/L，馬來(lái)酰肼終質(zhì)量濃度為2.2 g/L，此條件下獲得突變株UV-NTG-2的生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量分別為39.01 g/L、19.83%、7.74 g/L，較原始菌株分別提高了42.42%、52.30%、116.81%；在UV-DES復(fù)合誘變及淺藍(lán)菌素篩選中，紫外最佳誘變劑量為30 s，DES振蕩時(shí)間為100 min，淺藍(lán)菌素濃度為17.92 μmol/L，在此條件下獲得的突變株UV-DES-2的生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量分別為38.96 g/L、20.80%、8.10 g/L，較原始菌株分別提高了42.24%、59.75%、126.89%。連續(xù)傳代后油脂產(chǎn)量穩(wěn)定，油脂的低溫流動(dòng)性較原始菌株有所提高，具有遺傳穩(wěn)定性。菌株UV-DES-2產(chǎn)油能力較強(qiáng)，生長(zhǎng)性能良好，是一株具有開(kāi)發(fā)前景的優(yōu)良高產(chǎn)油脂菌株，以此菌株為基礎(chǔ)進(jìn)一步提高油脂含量將是后續(xù)研究中需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

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