羅 軍 袁紅伶 徐 劍 呂 琴

(昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032)

腎間質(zhì)纖維化是多種病因引起的腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同病理過(guò)程，其主要特點(diǎn)為腎小管擴(kuò)張或萎縮、間質(zhì)區(qū)大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)生成降解失衡及組織微血管損傷等。單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1可使炎癥因子向腎間質(zhì)聚集，導(dǎo)致局部微炎癥的發(fā)生，從而加重腎間質(zhì)纖維化，抑制炎癥因子的釋放與表達(dá)能有效緩解腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。本研究觀察不同濃度干擾素(IFN)-γ對(duì)大鼠腎成纖維細(xì)胞(NRK-49F)增殖及MCP-1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1一般材料 NRK-49F細(xì)胞株(ATCC)購(gòu)于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，IFN-γ購(gòu)于上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司，NRK-49F細(xì)胞培養(yǎng)試劑與RT-PCR試劑盒購(gòu)于云南杰美科技有限公司，兔抗鼠MCP-1抗體與兔抗鼠β-actin一抗購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)配制試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗及蛋白Marker購(gòu)于北京鼎國(guó)公司。

1.2儀器 Forma3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma scientific公司)、基因擴(kuò)增儀GeneAmp PCR System 9700(上海宏潤(rùn)醫(yī)療設(shè)備有限公司)、NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技)、Sigma 960酶標(biāo)儀(Metertech公司)、BG-Power 600i百晶電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司)、ChemidocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1NRK-49F細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃條件下在細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基根據(jù)細(xì)胞種類采用含12%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液。細(xì)胞以1×106/ml接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，傳代如常。

1.3.2不同終濃度的 IFN-γ對(duì)NRK-49F細(xì)胞進(jìn)行干預(yù) 將細(xì)胞接種于96 孔板，次日細(xì)胞貼壁后，換為含12%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，逐孔加入不同濃度的IFN-γ，使其終濃度分別為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml，加入等劑量0.9%的生理鹽水作為對(duì)照，每組IFN-γ濃度設(shè)定5個(gè)復(fù)孔，另外1個(gè)不加細(xì)胞只加等量的培養(yǎng)基作為調(diào)零孔，共31孔。分別培養(yǎng)12 h、24 h 及36 h 后，在每孔中加10 ml四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入 100 ml三聯(lián)裂解液，振蕩15 min，用酶標(biāo)儀以570 nm波長(zhǎng)比色，記錄光密度(OD)值。

1.3.3RT-PCR檢測(cè)MCP-1 mRNA表達(dá) 將細(xì)胞接種于6孔板，次日細(xì)胞貼壁后，換為含12%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，逐孔加入終濃度為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml的IFN-γ，加入等劑量0.9%的生理鹽水作為對(duì)照。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，分別進(jìn)行MCP-1及GADPH擴(kuò)增。MCP-1引物序列設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中mRNA序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，采用GADPH作為內(nèi)參，引物均由上海生工合成，MCP-1引物上游序列：5′-CAA TGA GTC GGC TGG AGA-3′，下游序列：5′-GCT TGA GGT GGT TGT GGA-3′，擴(kuò)增片段242 bp；GADPH引物上游序列：5′-TAG CCC AGG ATG CCC TTT ATT-3′，下游序列：5′-CCC CCA ATG TAT CCG TTG TG-3′，擴(kuò)增片段195 bp。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件為：42℃ 60 min；70℃ 5 min，共1個(gè)循環(huán)；PCR擴(kuò)增體系為10 μl，MCP-1：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s共35個(gè)循環(huán)，之后72℃延伸10 min，最后4℃無(wú)窮；GADPH：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s共35個(gè)循環(huán)，之后72℃延伸10 min，最后4℃無(wú)窮。取5 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物，采用2%瓊脂糖凝膠，于80 V恒壓電泳30 min，在化學(xué)發(fā)光成像儀顯影，采集圖片并分析數(shù)據(jù)。

1.3.4Western印跡檢測(cè)MCP-1蛋白表達(dá) 常規(guī)培養(yǎng)6孔板細(xì)胞長(zhǎng)至 85%～95%時(shí)，加入1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml的IFN-γ 200 μl干預(yù)24 h，另外設(shè)置一個(gè)加入等劑量的0.9%生理鹽水作為對(duì)照組。蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，分別等量點(diǎn)樣于10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)膜，封閉，將一抗MCP-1(1∶10 000)，β-actin(1∶10 000)置于4℃過(guò)夜，洗膜，二抗(1∶10 000)孵育，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光，X線顯影定影。Quatity One軟件進(jìn)行灰度分析

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1IFN-γ對(duì)NRK-49F細(xì)胞增殖的影響 隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，NRK-49F活細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，即促進(jìn)能力越強(qiáng)(P<0.05)，但I(xiàn)FN-γ對(duì)NRK-49F細(xì)胞的促進(jìn)作用與其濃度無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 IFN-γ對(duì)NRK-49F細(xì)胞增殖的影響值)

與同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組比較：1)P<0.05；與同濃度IFN-γ前一時(shí)點(diǎn)比較：2)P<0.05；下表同

2.2IFN-γ對(duì)NRK-49F細(xì)胞MCP-1 mRNA表達(dá)的影響 IFN-γ可上調(diào)NRK-49F細(xì)胞MCP-1 mRNA表達(dá)水平，且呈時(shí)間依賴關(guān)系(P<0.05)，但與濃度相關(guān)性不大(P>0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

1～6:對(duì)照組、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml組，下圖同圖1 各組NRK-49F細(xì)胞MCP-1 mRNA表達(dá)水平

2.3IFN-γ對(duì)NRK-49F細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組(1.454±0.447)相比，1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml IFN-γ能促進(jìn)NRK-49F細(xì)胞表達(dá)MCP-1蛋白(1.383±0.528、1.679±0.764、0.742±0.107、1.427±0.079、0.607±0.094，P<0.05)，但和IFN-γ濃度無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

表2 IFN-γ對(duì)NRK-49F細(xì)胞MCP-1 mRNA表達(dá)影響

圖2 各組NRK-49F細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)

3 討 論

IFN-γ是致炎作用很強(qiáng)的細(xì)胞因子，在機(jī)體炎癥反應(yīng)過(guò)程(包括遲發(fā)超敏反應(yīng)、炎癥、排斥反應(yīng)等)中起著非常重要的作用〔1〕。C-jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)中重要的通路之一，主要影響細(xì)胞凋亡、炎癥及腫瘤等病理形態(tài)〔2〕。JNK信號(hào)通路的活化是通過(guò)其氨基末端殘基磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)的，激活之前分布于細(xì)胞質(zhì)中，一旦被激活，細(xì)胞質(zhì)中的JNK會(huì)迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)凋亡蛋白(AP)-1的表達(dá)〔3〕。研究表明IFN-γ主要通過(guò)激活JNK信號(hào)通路，活化的JNK進(jìn)入細(xì)胞核，使轉(zhuǎn)錄因子AP-1蛋白活性增強(qiáng)，促使DNA表達(dá)MCP-1，MCP-1又會(huì)介導(dǎo)炎癥因子的聚集，從而加快了炎癥的進(jìn)展〔4，5〕。MCP-1是一種重要的特異性細(xì)胞趨化因子，具有趨化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能，在臟器纖維化的過(guò)程中具有重要作用〔6〕。在腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中，MCP-1主要趨化巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)腎間質(zhì)，在ECM的合成與分泌發(fā)揮重要作用〔7〕。抑制MCP-1的表達(dá)可阻止腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，改善腎間質(zhì)局部微環(huán)境，減少ECM的合成，從而改善和延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程〔8〕。本研究結(jié)果顯示IFN-γ對(duì)NRK-49F細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，這與劉海林等〔9，10〕結(jié)果類似。出現(xiàn)這一與實(shí)驗(yàn)預(yù)期相反的結(jié)果，研究組初步認(rèn)為這可能與NRK-49F細(xì)胞系本身有關(guān)，NRK-49F細(xì)胞系本身為活化的細(xì)胞，其表現(xiàn)出活化后的諸多特性，而IFN-γ只能抑制未活化的NRK-49F的增殖，對(duì)活化的NRK-49F卻產(chǎn)生相反的作用。

通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)：不同終濃度的IFN-γ干預(yù)NRK-49F細(xì)胞MCP-1的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，MCP-1在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展中表現(xiàn)為正調(diào)控，這表明IFN-γ在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)無(wú)抗腎間質(zhì)纖維化的特性。出現(xiàn)這一結(jié)果研究組認(rèn)為存在以下原因：NRK-49F細(xì)胞株本身就是活化的細(xì)胞，IFN-γ只能對(duì)尚未活化的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞起作用，對(duì)于已活化的NRK-49F細(xì)胞反而其促進(jìn)增殖作用；IFN-γ本身具有抗腎間質(zhì)纖維化的特性，但在體外單一細(xì)胞環(huán)境下，IFN-γ抗腎間質(zhì)纖維化的特性沒(méi)有被激發(fā)；NRK-49F細(xì)胞在IFN-γ的干預(yù)下，可能引起NRK-49F細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而活化了NRK-49F細(xì)胞，表現(xiàn)諸多促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的性質(zhì)；IFN-γ根本不具備抗腎間質(zhì)纖維化的特性，而是表現(xiàn)促腎間質(zhì)纖維化的性質(zhì)。體內(nèi)研究與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)存在巨大的差異，IFN-γ在體內(nèi)是否具有抗腎間質(zhì)纖維化的特性，仍需大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床研究來(lái)證實(shí)。

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