, , , , *

(1. 貴州省疾病預(yù)防控制中心, 貴陽(yáng) 550004; 2. 貴州師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 貴陽(yáng) 550018)

甲硝唑(MNZ)是人工合成的硝基咪唑類(lèi)藥物,廣泛用于預(yù)防和治療組織滴蟲(chóng)病、球蟲(chóng)病等疾病[1]。近年來(lái),甲硝唑被許多蜂農(nóng)用來(lái)預(yù)防和控制蜜蜂孢子蟲(chóng)病,因療效明顯,價(jià)格低廉,被蜂農(nóng)廣泛使用,這造成了甲硝唑藥物在蜂蜜中殘留[2]。甲硝唑?qū)?xì)菌有誘變作用,對(duì)人體具有神經(jīng)毒性和潛在致癌性[3]。為防止甲硝唑殘留對(duì)人體健康產(chǎn)生危害,歐盟、加拿大、美國(guó)等禁止甲硝唑用于食源性動(dòng)物養(yǎng)殖。我國(guó)農(nóng)業(yè)部和國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2002年頒布的227號(hào)公告規(guī)定甲硝唑及其鹽、酯及制劑不準(zhǔn)以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)為目的在所有食品動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中使用。為了解蜂蜜中甲硝唑的殘留現(xiàn)狀,建立準(zhǔn)確、快速地測(cè)定蜂蜜中甲硝唑含量的方法十分必要。

目前,甲硝唑的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[4]、液相色譜-質(zhì)譜法或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-9]、氣相色譜法[10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11]等。氣相色譜法和高效液相色譜法只能依靠保留時(shí)間定性,蜂蜜基質(zhì)干擾嚴(yán)重,且甲硝唑殘留量低,檢出限達(dá)不到要求;氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定時(shí)甲硝唑需衍生化,受衍生效率的影響;雖然液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、檢出限低等特點(diǎn),但是蜂蜜中甲硝唑的殘留量接近高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)的檢出限,還需要提高樣品的前處理技術(shù)進(jìn)行富集凈化。本工作以固相萃取柱富集凈化,采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)測(cè)定蜂蜜中甲硝唑的含量。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Thermo Ultimate 3000型超高效液相色譜儀;TSQ Quantum ultra型三重四極桿質(zhì)譜儀,配電噴霧離子源;3-18K型臺(tái)式高速離心機(jī);TTL-DC Ⅱ型氮吹儀;Aquaplus型超純水機(jī);IKA MS3型渦旋混勻器;KQ-700DV型數(shù)控超聲波清洗器;MCS固相萃取柱(500 mg/6 mL)。

甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.000 g·L-1,稱(chēng)取甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于99.5%) 10 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,-18 ℃冰箱保存。

D4-甲硝唑(內(nèi)標(biāo))儲(chǔ)備溶液:0.100 g·L-1,取D4-甲硝唑1 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,-18 ℃冰箱保存。

磷酸氫二鉀溶液:0.5 mol·L-1,稱(chēng)取三水合磷酸氫二鉀57.00 g,用水配制成500 mL溶液。

甲酸、甲醇和乙腈為色譜純,氨水、鹽酸為優(yōu)級(jí)純,乙酸乙酯、磷酸氫二鉀為分析純,試驗(yàn)用水為超純水。

1．2 儀器工作條件

1) 色譜條件 Hypersil Gold-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,1.9 μm),柱溫為30 ℃;進(jìn)樣體積為10 μL;流量為0.3 mL·min-1。流動(dòng)相:A為0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～0.5 min時(shí),A為95%;0.5～5.5 min時(shí),A由95%降至10%,保持1.5 min;7.0～7.1 min時(shí),A由10%升至95%。

2) 質(zhì)譜條件 電噴霧正離子源(ESI+),噴霧電壓3 kV;毛細(xì)管溫度350 ℃,蒸發(fā)溫度270 ℃;鞘氣壓力270 kPa,輔助氣壓力104 kPa;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。其余質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1,其中“*”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab. 1 MS parameters

1．3 試驗(yàn)方法

1) 樣品提取 稱(chēng)取試樣5.00 g于50 mL聚丙烯刻度離心管中,分別加入40 μg·L-1D4-甲硝唑溶液200 μL和0.5 mol·L-1磷酸氫二鉀溶液10 mL,渦旋溶解,再加入乙酸乙酯10 mL,渦旋提取2 min,以10 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心3 min。移取上層乙酸乙酯5 mL于10 mL試管中,水浴50 ℃氮吹干,加入甲醇-40 mmol·L-1鹽酸(5+95)溶液2.0 mL,超聲溶解1 min,溶解液待凈化。

2) 樣品凈化 依次用甲醇5 mL、40 mmol·L-1鹽酸溶液5 mL活化MCS固相萃取柱,將上述溶解液轉(zhuǎn)移至MCS固相萃取柱內(nèi)。待溶解液過(guò)柱后,依次用水5 mL、甲醇5 mL淋洗雜質(zhì),真空抽干后用氨化甲醇(5+95)溶液5 mL洗脫。收集洗脫液于50 ℃下氮吹至干,加入0.1%甲酸-乙腈(90+10)溶液1.0 mL溶解殘留物,渦旋混勻10 s,過(guò)0.22 μm濾膜,按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜行為

甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的MRM圖見(jiàn)圖1。

2．2 儀器工作條件的選擇

甲硝唑呈弱堿性,使用ESI+模式進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行全掃描,找出準(zhǔn)分子離子峰,通過(guò)改變?cè)囼?yàn)條件(毛細(xì)管溫度、蒸發(fā)溫度等),使母離子以最大效率通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜,并且以此準(zhǔn)分子離子峰為母離子進(jìn)行轟擊,進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,找出兩個(gè)信號(hào)較強(qiáng)的碎片離子構(gòu)成監(jiān)測(cè)離子對(duì)。選擇不同的碰撞電壓和滯留時(shí)間優(yōu)化特征離子,選擇的碰撞電壓和離子對(duì)見(jiàn)表1。

在流動(dòng)相中加低含量的甲酸可得到更加豐富的離子碎片信息,改善甲硝唑峰形,提高測(cè)定的靈敏度。試驗(yàn)選擇0.1%甲酸溶液和乙腈作為流動(dòng)相,進(jìn)行二元梯度洗脫。

(a) 甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液 (b) 樣品 圖1 甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的MRM圖Fig. 1 MRM chromatograms of metronidazole standard solution and the sample

2．3 樣品提取條件的選擇

考察了二氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈為提取劑時(shí)對(duì)測(cè)定的影響。結(jié)果表明:二氯甲烷毒性大,不利于試驗(yàn)人員的健康;文獻(xiàn)[1]中報(bào)道乙酸乙酯和乙腈對(duì)甲硝唑的提取效率相當(dāng),乙腈作為提取劑時(shí),需加入氯化鈉促使分層,且沸點(diǎn)較高,濃縮耗時(shí)較長(zhǎng)。試驗(yàn)選擇乙酸乙酯作為提取劑。

蜂蜜基質(zhì)的物理性狀差別較大,直接使用有機(jī)溶劑提取時(shí)很難完全混勻,所以需用水或0.5 mol·L-1磷酸氫二鉀溶液(pH約為8.8)稀釋溶解蜂蜜后再用有機(jī)溶劑提取。甲硝唑是弱堿性化合物,酸性條件下呈質(zhì)子化狀態(tài),不易進(jìn)入有機(jī)相,在弱堿性條件下呈游離分子狀態(tài)。試驗(yàn)考察了用水和0.5 mol·L-1磷酸氫二鉀溶液稀釋溶解蜂蜜對(duì)甲硝唑回收率的影響。結(jié)果表明:使用水、0.5 mol·L-1磷酸氫二鉀溶液稀釋溶解蜂蜜時(shí)甲硝唑的回收率依次為93.0%,82.0%。試驗(yàn)選擇0.5 mol·L-1磷酸氫二鉀溶液稀釋溶解蜂蜜后用乙酸乙酯提取蜂蜜中甲硝唑。

2．4 基質(zhì)效應(yīng)的影響

基質(zhì)和干擾組分的存在影響待測(cè)物的離子化效率,從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性,常表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)或基質(zhì)抑制效應(yīng)。試驗(yàn)分別采用空白蜂蜜按照試驗(yàn)方法提取與凈化后的定容液和初始流動(dòng)相作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶劑,通過(guò)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積的比值考察基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱。結(jié)果表明:兩者的峰面積比值為0.757,這表明蜂蜜基質(zhì)對(duì)甲硝唑的測(cè)定具有一定的抑制效應(yīng),可采用內(nèi)標(biāo)法或基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量,從而有效地降低樣品的基質(zhì)效應(yīng)。試驗(yàn)選擇同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

2．5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與測(cè)定下限

用0.1%甲酸-乙腈(90+10)溶液將1.000 g·L-1甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋成0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0,32.0,64.0 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,其中D4-甲硝唑內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度為4.0 μg·L-1。在儀器工作條件下對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以甲硝唑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的甲硝唑峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:甲硝唑的線性范圍為0.5～64.0 μg·L-1,線性回歸方程為y=0.431x-0.005,相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

以10倍信噪比計(jì)算方法的測(cè)定下限(10S/N)為0.15 μg·kg-1。

2．6 方法的精密度和回收試驗(yàn)

在空白蜂蜜樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),平行測(cè)定6次,其結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab. 2 Results of tests for precision and recovery(n=6)

由表2可知:加標(biāo)回收率為95.6%～98.8%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.2%～8.3%。

2．7 樣品分析

按試驗(yàn)方法對(duì)在某超市隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)的30批次蜂蜜樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:26批次蜂蜜樣品中未檢出甲硝唑,4批次蜂蜜樣品中檢出甲硝唑,檢出率為13.3%,甲硝唑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4～6.5 μg·kg-1。這說(shuō)明蜂農(nóng)在養(yǎng)蜂過(guò)程中濫用甲硝唑藥物預(yù)防和控制蜜蜂疾病等現(xiàn)象仍有發(fā)生。

本工作采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中甲硝唑,有效地減少了基質(zhì)對(duì)甲硝唑測(cè)定的干擾,該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、測(cè)定下限低、快速、靈敏、準(zhǔn)確。

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