張麗琴，管海寧，肖作淼，劉聰，肖九長(zhǎng)

陰溝腸桿菌是一種常見(jiàn)的條件致病菌，可導(dǎo)致傷口、呼吸道、泌尿道的嚴(yán)重感染，且多為醫(yī)院內(nèi)感染[1]。由于臨床廣泛地使用廣譜抗菌藥物治療陰溝腸桿菌引起的感染，導(dǎo)致陰溝腸桿菌檢出及對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性逐年上升，造成耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重[2]。陰溝腸桿菌的耐藥機(jī)制多而復(fù)雜，關(guān)于主動(dòng)外排系統(tǒng)的研究較少，為了解AcrABTolC外排系統(tǒng)在贛南地區(qū)臨床分離陰溝腸桿菌中的攜帶情況及介導(dǎo)耐藥性形成中的作用，我們對(duì)AcrAB-TolC外排系統(tǒng)的 acrA，acrB，acrR和 tolC四種基因進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)其與陰溝腸桿菌耐藥性的關(guān)系進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集贛南地區(qū)三所三甲綜合醫(yī)院2015年1月至2015年6月從呼吸道、泌尿道、傷口等臨床標(biāo)本中分離的陰溝腸桿菌共136株，剔除同一患者相同部位分離的重復(fù)菌株，所有菌株經(jīng)Vitek 2 compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定和藥敏。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.2 主要儀器及試劑 法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的Vitek 2 compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)及配套的GN、AST-GN16卡；PCR擴(kuò)增儀為德國(guó)艾本德公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠電泳儀為美國(guó)博樂(lè)公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為法國(guó)VILBER公司產(chǎn)品。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Taq DNA Polymerase cat.No.：B500010（內(nèi)含：10×buffer、Mg2+、Taq DNA Polymerase） 和 dNTP購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 目的基因的PCR檢測(cè) 細(xì)菌DNA的提取嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將已提取的陰溝腸桿菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物由上海生工合成，詳見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系均為20μl：10×buffer 2.0μl，Mg2+（25mM）1.2μl，dNTP（2.5mM）1.6μl，Taq DNA Polymerase （5U/μl）0.5μl， 上 、 下 游 引 物（10μM） 各 1.0μl，DNA 模板 2.0μl，ddH2O 10.7μl。反 應(yīng) 條 件 ：acrA 基 因 ：95℃ ，5min→（95℃ ，30s+60℃，30s+72℃，30s)×30 循 環(huán)→72℃，10min；acrB基因：95℃，5min→（95℃，30s+60℃，30s+72℃，30s)×30 循 環(huán)→72℃，10min；acrR 基 因 ：94℃，4min→（95℃，30s+48℃，30s+72℃，1min)×30 循環(huán)→72℃，10min；tolC 基 因 ：95℃ ，5min→（95℃ ，30s+60℃ ，30s+72℃，30s)×30 循環(huán)→72℃，10min。 反應(yīng)結(jié)束后取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)含Goldview I型核酸染色劑的2%瓊脂糖凝膠電泳40min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。將PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送上海生工測(cè)序，在基因庫(kù)中比對(duì)分析。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用WHONET 5.6和SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，耐藥率的組間比較采用u檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 目的基因的引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

2 結(jié)果

2.1 陰溝腸桿菌的藥敏結(jié)果 136株陰溝腸桿菌對(duì)頭孢曲松的耐藥率高達(dá)52.2%，氨曲南、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、慶大霉素等抗菌藥物的耐藥率均在30%以上，亞胺培南的耐藥率已高達(dá)15.4%，未出現(xiàn)替加環(huán)素耐藥株。

2.2 目的基因的檢測(cè)結(jié)果 136株陰溝腸桿菌中，tolC、acrR、acrA及 acrB基因的檢出率分別為95.6%、80.9%、70.6%和61.7%，其中tolC基因檢出率顯著高于其它三種基因。同時(shí)攜帶四種基因的菌株最多，占36.8%（50/136）。部分菌株四種基因PCR產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖1?；驕y(cè)序結(jié)果在NCBI基因庫(kù)中比對(duì)分析顯示，acrA基因序列與登錄號(hào)AM287286陰溝腸桿菌的同源性為98%；acrB基因序列與登錄號(hào)AM287287陰溝腸桿菌的同源性為99%；tolC基因序列與登錄號(hào)AM287288陰溝腸桿菌的同源性為98%；acrR基因序列與登錄號(hào)EF627524陰溝腸桿菌的同源性為99%。

圖1 部分陰溝腸桿菌四種基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

2.3 外排系統(tǒng)基因與常用抗菌藥物耐藥之間的關(guān)系 根據(jù)外排系統(tǒng)基因的攜帶進(jìn)行分組比較136株陰溝腸桿菌對(duì)四類常用抗菌藥物的耐藥率。分組情況為：四種基因全（+）組與 acrA（+）acrB（-）tolC（+）acrR（+）組、acrA（+）與 acrA（-）組、acrB（+）與 acrB（-）組、tolC（+）與 tolC（-）組、acrR（+）與acrR（-）組。 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：4(+)組和 3(+)組比較 P=0.771>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各外排系統(tǒng)基因陽(yáng)性組的耐藥率均高于相應(yīng)外排系統(tǒng)基因陰性組 （P<0.01），有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

3 討論

2014年和2015年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告陰溝腸桿菌在革蘭陰性菌分離中排第五位，是醫(yī)院感染的重要病原菌。本實(shí)驗(yàn)136株陰溝腸桿菌藥敏結(jié)果顯示，臨床使用最廣泛的三代頭孢菌素的耐藥率高達(dá)50%以上，特別是作為治療腸桿菌科細(xì)菌最佳藥物的碳青霉烯耐藥率已高達(dá)15.4%，提示多重耐藥甚至泛耐藥的陰溝腸桿菌在贛南地區(qū)的檢出不在少數(shù)，且耐藥問(wèn)題不容樂(lè)觀。

陰溝腸桿菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是其主要耐藥機(jī)制，但在細(xì)菌多重耐藥性產(chǎn)生過(guò)程中主動(dòng)外排系統(tǒng)也發(fā)揮了重要作用[3-5]。AcrAB-TolC外排系統(tǒng)隸屬于主動(dòng)外排系統(tǒng)的耐藥結(jié)節(jié)分化超家族。該系統(tǒng)廣泛存在于大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌等腸桿菌科細(xì)菌中，它可主動(dòng)將進(jìn)入菌體內(nèi)的抗生素泵出，使藥物濃度下降難以發(fā)揮抗菌作用而出現(xiàn)耐藥[6，7]。 acrA，acrB，tolC 和acrR四種基因存在于染色體上，可編碼AcrABTolC外排系統(tǒng)[8]。

表2 根據(jù)基因攜帶分組比較四類常用抗菌藥物的耐藥率（%）

本研究顯示，acrA，acrB，tolC和acrR四種基因的攜帶率均在60%以上，其中tolC基因的檢出率最高，acrB基因的檢出率最低，說(shuō)明AcrAB-TolC外排系統(tǒng)基因在陰溝腸桿菌中普遍且差異性的存在；另外，此次分離的陰溝腸桿菌不但在藥敏結(jié)果上與別的地區(qū)之間有所差異，而且基因攜帶方面tolC基因的檢出最為顯著，也異于其它文獻(xiàn)報(bào)道[9]。一方面可能與地域差別有關(guān)，另一方面可能與各地區(qū)各醫(yī)院之間臨床抗菌藥物的使用習(xí)慣有關(guān)。胡小行等報(bào)道[10]外排系統(tǒng)在陰溝腸桿菌敏感株和耐藥株中均存在，但對(duì)耐藥株的影響大于敏感株。文中通過(guò)分組比較耐藥率的結(jié)果顯示各外排系統(tǒng)基因陽(yáng)性組的耐藥率均高于相應(yīng)外排系統(tǒng)基因陰性組 （P<0.01），說(shuō)明AcrAB-TolC外排系統(tǒng)在陰溝腸桿菌的耐藥形成中發(fā)揮了重要的作用；4(+)組和3(+)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義反映AcrAB-TolC外排系統(tǒng)的各種基因可能存在聯(lián)合作用。文獻(xiàn)報(bào)道AcrAB-TolC外排系統(tǒng)基因高表達(dá)表現(xiàn)出對(duì)多種常用抗菌藥物包括β內(nèi)酰胺類、甲氧芐啶、喹諾酮等耐藥[11-13]。盡管此次未在基因表達(dá)上進(jìn)行更深入研究，但對(duì)AcrAB-TolC外排系統(tǒng)基因分布及耐藥相關(guān)性問(wèn)題有了深刻的認(rèn)識(shí)。另外，在碳青霉烯類耐藥的多重耐藥陰溝腸桿菌中，也可能存在其它耐藥機(jī)制（高產(chǎn)AmpC酶、ESBLs、碳青霉烯酶等）的協(xié)同作用[14，15]，造成了陰溝腸桿菌高水平的耐藥現(xiàn)象，其具體的基因型仍需進(jìn)一步有針對(duì)性地研究。綜上所述，AcrAB-TolC外排系統(tǒng)在陰溝腸桿菌耐藥形成中具有不可忽視的作用，加強(qiáng)陰溝腸桿菌耐藥機(jī)制的基礎(chǔ)研究，可為尋求防治陰溝腸桿菌耐藥途徑提供依據(jù)。