中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081

中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究是闡明中藥的藥效物質(zhì)、藥理活性、作用機(jī)制和臨床療效的先決條件，也是直接影響中藥單味藥物和復(fù)方制劑開(kāi)發(fā)、藥物炮制工藝、劑型改進(jìn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的重要基礎(chǔ)，也是中藥現(xiàn)代化的重要研究?jī)?nèi)容和組成部分。中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效的研究已經(jīng)有近80年的歷史，目前，中藥單味藥和復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)，并且取得了很大的成就，如我國(guó)著名中藥研究者屠呦呦從中藥青蒿中提取到抗瘧疾作用成分青蒿素，并獲得了2015年的諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，研究者在青蒿素的基礎(chǔ)之上合成雙氫青蒿素等近百種青蒿素衍生物，治療和挽救了無(wú)數(shù)瘧疾患者的生命[1]。

中藥中含有的有效成分具有種類(lèi)多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同時(shí)相互之間又有協(xié)同或拮抗作用，構(gòu)成中藥的多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的復(fù)雜體系，給中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究帶來(lái)了巨大的困難和挑戰(zhàn)。再加上中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究濃厚的化學(xué)背景，從而促使大部分研究者把目光集中在對(duì)黃酮、皂苷等次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究上，而忽略了對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等初級(jí)代謝產(chǎn)物作用的研究。雖然初級(jí)代謝產(chǎn)物大多為大分子物質(zhì)，在消化道中被分解成為最小的基本單位被集體吸收利用，但部分小分子初級(jí)代謝產(chǎn)物可以以整體性形式被穩(wěn)定地吸收進(jìn)入體內(nèi)并發(fā)揮其藥理作用，這給中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新的研究思路和方法。

1 中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究存在的問(wèn)題

中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究思路與方法源于西方重視因果關(guān)系的哲學(xué)思想體系和對(duì)于植物化學(xué)研究，即對(duì)中藥中有效成分進(jìn)行提取、分離、結(jié)構(gòu)鑒定、活性篩選等步驟進(jìn)行物質(zhì)基礎(chǔ)研究以闡明其作用。中藥研究采取此類(lèi)研究方法對(duì)中藥的化學(xué)成分和生物活性進(jìn)行研究，揭示了一大批中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)，取得了重要的研究成果，如中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院的屠呦呦教授等發(fā)現(xiàn)青蒿素是青蒿中抗瘧的主要有效成分、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院陳克恢教授發(fā)現(xiàn)麻黃堿是麻黃利尿調(diào)節(jié)血壓的主要有效成分[1-2]。目前對(duì)于中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究主要集中于中藥的次級(jí)代謝產(chǎn)物，雖然能夠在很大程度上說(shuō)明大部分中藥的藥物作用基礎(chǔ)，但是僅從次級(jí)代謝產(chǎn)物藥理作用分析的角度仍然難以對(duì)部分中藥的藥物作用物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行合理解釋。

目前大部分的研究集中于在次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)于初級(jí)代謝產(chǎn)物是否為中藥作用物質(zhì)基礎(chǔ)的問(wèn)題成為了研究的新方向。從生物化學(xué)的角度來(lái)看，外源性的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等初級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)入消化道后均被降解成為最基本的氨基酸、甘油、核苷酸等最小單位被吸入體內(nèi)，如核酸的分解過(guò)程：外源性的核酸物質(zhì)在生物體內(nèi)在多種酶的催化下，水解生成核苷等小分子物質(zhì)被吸收[3]，導(dǎo)致普遍認(rèn)為蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸經(jīng)消化吸收后就失去其生物活性?，F(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)外源性的植物miRNA可在人體內(nèi)穩(wěn)定存在，部分研究還發(fā)現(xiàn)一些中藥的miRNA存在一定的藥理活性。中藥所含的植物miRNA是否是中藥藥物作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，成為新的中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究關(guān)注點(diǎn)[4-6]。

2 miRNA在人體內(nèi)的存在

微小RNA(microRNA，miRNA)是由真核生物內(nèi)源性發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物衍生而來(lái)的一種長(zhǎng)19～25nt的單鏈RNA。miRNA可作為一種引導(dǎo)性分子通過(guò)堿基配對(duì)與靶mRNA結(jié)合從而在轉(zhuǎn)錄后引起靶mRNA的剪切或翻譯的抑制，從而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。研究表明，miRNA在不同調(diào)節(jié)途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括造血細(xì)胞的分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖以及腫瘤的形成等方面[7]，并發(fā)現(xiàn)miRNA與RNA病毒和DNA病毒在致病性及病毒與宿主的相互作用方面具有一定的作用[8-9]。目前對(duì)于miRNA的具體作用機(jī)制尚不清楚，主要由于miRNA與其靶mRNA形成一種復(fù)雜的作用網(wǎng)絡(luò)。例如，一種miRNA可以結(jié)合并調(diào)節(jié)多種mRNA，與此同時(shí)，一個(gè)mRNA可與多個(gè)miRNA結(jié)合，故其作用機(jī)制復(fù)雜多樣。miRNA的具體作用機(jī)制仍然是一個(gè)待解決的科學(xué)難題，對(duì)于miRNA的調(diào)節(jié)作用網(wǎng)絡(luò)的研究尚處于起步狀態(tài)。

外源性植物miRNA可以直接被哺乳動(dòng)物從食物中吸收，并且在血漿和組織之中。Lin Zhang等在利用Solexesa測(cè)序法發(fā)現(xiàn)中國(guó)人的血漿中發(fā)現(xiàn)了十字花科植物的miRNA---MIR156a和MIR168a的存在，推測(cè)與中國(guó)人以水稻為主食的飲食習(xí)慣有關(guān)。實(shí)驗(yàn)利用RT-PCR和Northern Blotting技術(shù)對(duì)于這兩種外源性植物miRNA的含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)這兩種外源性植物miRNA在人體血液中濃度很高，利用高碘酸對(duì)于血液中的外源性植物miRNA進(jìn)行了進(jìn)一步的處理測(cè)定，進(jìn)一步驗(yàn)證了這兩種miRNA在人體體內(nèi)的存在。進(jìn)一步研究miRNA的吸收過(guò)程，發(fā)現(xiàn)了miRNA是以整體形式通過(guò)被囊泡包裹吸收的形式經(jīng)小腸吸收如體內(nèi)[6]。Jonathan W. Snow等[10]進(jìn)一步驗(yàn)證了外源性植物miRNA通過(guò)腸胃吸收進(jìn)入人體，并以不同濃度存在于各個(gè)器官之中。Anna Lukasik等[11]發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)樣本中的高豐度水平的MIR168a等基因，可以通過(guò)血乳屏障在豬的母乳中檢測(cè)，并確定了其通過(guò)量的最大值。這些人體對(duì)于外源性植物miRNA吸收分布的研究為中藥miRNA作為中藥作用有效物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮藥物作用的研究奠定了基礎(chǔ)。

3 外源性中藥miRNA的藥理作用

甘草具有調(diào)節(jié)免疫等作用，能調(diào)和百藥解百毒，更有“國(guó)老”之稱(chēng)、“十方九草”之說(shuō)。目前對(duì)于甘草的增強(qiáng)免疫力作用效果的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制尚不清楚。邵紅偉等[5]利用植物miRNA提取試劑盒從甘草水提物凍干粉中提取并純化獲得甘草miRNA，利用所提取的甘草miRNA作用于健康人血中分離的外周血單核細(xì)胞(PBMC)，從細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞數(shù)量鑒定細(xì)胞的增值情況以反應(yīng)甘草miRNA對(duì)免疫細(xì)胞的影響。對(duì)比了甘草miRNA與甘草水提物、甘草酸、甘草次酸的對(duì)PBMC的影響結(jié)果表明，甘草miRNA組PMBC細(xì)胞出現(xiàn)明顯的抱團(tuán)現(xiàn)象，且抱團(tuán)數(shù)量明顯增多，證明了甘草miRNA對(duì)于PBMC的促進(jìn)作用，為解釋甘草的調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新的證據(jù)。

向靜等[12]利用從甘草水煎劑中提取的miRNA以及合成的甘草miRNA模擬物作用于PBMC，再一次證實(shí)甘草miRNA具有明顯的免疫調(diào)節(jié)功能，并利用RT-PCR對(duì)其模式識(shí)別受體(PRR) 基因以及部分轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)分子和細(xì)胞因子的基因表達(dá)變化進(jìn)行分析。結(jié)果表明，甘草miRNA對(duì)免疫細(xì)胞表面的一類(lèi)模式識(shí)別受體TLR家族中的TLR1、TLR9表達(dá)上調(diào)作用，對(duì)TLR4和TLR8的表達(dá)則有下調(diào)的作用。甘草miRNA能夠使得AP-1的重要組分c-JUN和c-FOS表達(dá)下降，說(shuō)明其通過(guò)抑制AP-1通路來(lái)抑制Th2細(xì)胞分化。甘草miRNA還降低了NF-kB，p53和STAT1的表達(dá)，說(shuō)明其可能抑制了炎癥通路、凋亡以及Th1細(xì)胞的分化。值得關(guān)注的是，促炎因子IL-6的表達(dá)在miRNA組和總提物組相反，說(shuō)明甘草水煎劑中成分和作用的復(fù)雜性，其整體作用效果可能是是由甘草miRNA與甘草所含次級(jí)代謝產(chǎn)物共同作用產(chǎn)生的。

金銀花具有良好的清熱解毒作用，廣泛應(yīng)用于各種病毒性感冒，但目前基于金銀花抗病毒作用的次級(jí)代謝產(chǎn)物成分藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究難以說(shuō)明金銀花的抗病毒作用。Zhen Zhou等[6]利用金銀花水煎液中提取的miRNA2911分別進(jìn)行體內(nèi)和體外的抗病毒實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)于流感A類(lèi)病毒具有廣譜抗流感病毒作用，特別是H1N1、H5N1和H7N9病毒。該研究首先證明了miRNA2911能在金銀花水煎液中穩(wěn)定存在，并能夠被人體吸收。根據(jù)金銀花中miRNA2911的序列進(jìn)行人工合成，利用合成的miRNA2911提取物對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃實(shí)驗(yàn)，在外周血及肺部中都能顯著發(fā)現(xiàn)miRNA2911的存在，并利用無(wú)效的miRNA2911類(lèi)似序列核苷酸進(jìn)行抗病毒實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其可以在體內(nèi)檢測(cè)到，但是無(wú)抗病毒效果。隨后利用抗miRNA2911的核苷酸序列與miRNA2911同時(shí)灌胃，也無(wú)抗病毒效果。該研究直接證明了金銀花的抗病毒作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一是其含有的miRNA2911。

4 討論

中藥miRNA的相關(guān)研究給中藥作用物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了一個(gè)新的研究思路，藥物的作用物質(zhì)基礎(chǔ)不僅僅局限于次級(jí)代謝產(chǎn)物也可能是核酸等初級(jí)代謝產(chǎn)物，這為中藥的質(zhì)量控制、新藥開(kāi)發(fā)等提供了一個(gè)新的研究方向。在中藥作用物質(zhì)基礎(chǔ)研究方面，很多中藥的次級(jí)代謝產(chǎn)物的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)都難以說(shuō)明某些藥物作用，如金銀花的抗病毒作用等。這類(lèi)問(wèn)題可以嘗試從miRNA的角度去建立研究方法。在藥物開(kāi)發(fā)上，如果發(fā)現(xiàn)某個(gè)中藥的藥效作用的有效成分是miRNA，則可以嘗試使用PCR技術(shù)對(duì)于相應(yīng)的miRNA片段進(jìn)行擴(kuò)增或者人工合成，制成注射劑、片劑等生物制劑，使得中藥的衍生產(chǎn)品更加豐富，患者用藥更加方便，藥物生產(chǎn)效率，降低成本。在某些中藥質(zhì)量控制和藥物炮制過(guò)程中，miRNA的種類(lèi)和含量的改變同樣值得關(guān)注。

雖然miRNA作為中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究的前景十分可觀，但是對(duì)于其后續(xù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面所涉及的問(wèn)題仍然值得思考。miRNA的具體作用機(jī)制尚不完全清楚，其開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面也必然會(huì)受到一定的限制。首先，中藥所含的miRNA雖然被證明是中藥藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，但是miRNA本身是一種核酸，其制劑開(kāi)發(fā)應(yīng)用就會(huì)從中藥資源開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)變成為基因治療藥物開(kāi)發(fā)，不可避免會(huì)涉及基因治療的倫理問(wèn)題，必須衡量其實(shí)用性和風(fēng)險(xiǎn)性。其次，在應(yīng)用的技術(shù)問(wèn)題上，也存在許多問(wèn)題，如目的基因表達(dá)可控性差、miRNA多靶點(diǎn)引起的副作用、使用劑量的考核、人體排出體外和體內(nèi)積累等問(wèn)題，其中最令人擔(dān)憂(yōu)的是長(zhǎng)期安全性和耐藥性的產(chǎn)生。

隨著技術(shù)水平的不斷提高，新發(fā)現(xiàn)和新理論的提出，都進(jìn)一步深化了中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究，但是目前面臨的待解決的問(wèn)題仍然很多。例如文章提出的“miRNA可能是中藥藥物作用新機(jī)制”的觀點(diǎn)仍需要更多的實(shí)驗(yàn)研究證明，其后續(xù)相關(guān)研究仍有很多問(wèn)題亟待解決，中藥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)仍需最大限度地運(yùn)用現(xiàn)代相關(guān)技術(shù)進(jìn)一步分析。

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