，，

艾滋病、非典型性肺炎、人禽流感、病毒性肝炎等病毒性傳染性疾病(Viral Infectious Disease)具有傳染性強(qiáng)，容易引起大規(guī)模暴發(fā)流行等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅公眾健康。當(dāng)前病毒主要快速檢測(cè)方法包括基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法和基于病毒核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)核酸拷貝數(shù)量、靈敏度高、檢測(cè)速度快、不容易污染等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于病毒性病原體的快速檢測(cè)。本文就近年來(lái)實(shí)時(shí)熒光定量PCR在各種病毒的快速檢測(cè)，尤其是在狂犬病病毒及狂犬病病毒屬檢測(cè)中的應(yīng)用和發(fā)展前景作詳細(xì)介紹。

1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction，qPCR)是能夠定量監(jiān)測(cè)目的基因擴(kuò)增數(shù)量的PCR新技術(shù)。原理是在PCR體系中加入熒光染料或熒光分子標(biāo)記的寡核苷酸鏈，與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合時(shí)熒光分子在紫外線的激發(fā)下發(fā)出熒光，通過(guò)熒光信號(hào)探測(cè)器直接檢測(cè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的變化，來(lái)監(jiān)測(cè)目的基因的拷貝數(shù)量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。Navarro等[1]將熒光標(biāo)記的方法分為兩類：1)雙鏈DNA結(jié)合染料，如SYBRGreen I和Eva Green等；2)應(yīng)用熒光標(biāo)記的寡核苷酸鏈，包括3種類型：①熒光探針(Probe)，包括：水解探針(Hydrolysis probes)和雜交探針(Hybridization probe)；②熒光引物探針(Primer-Probe)，如：Scorpion primer-probes、AmplifluorTMprimer-probes等；③核酸類似物(Nucleic acid analogues)，如：LNA(Locked Nucleic Acids，鎖定核酸)、PNAs(Peptide nucleic acids)、ZNA(Zip nucleic acids)等。主要定量方法包括：1)絕對(duì)定量，構(gòu)建基因序列標(biāo)準(zhǔn)品并進(jìn)行定量，將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋并檢測(cè)得到每個(gè)稀釋度的Ct值，Ct值是熒光達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù)，以核酸數(shù)量為橫坐標(biāo)，以log(Ct)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)待檢樣品的Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的位置得到樣本所包含的核酸量；2)相對(duì)定量，根據(jù)數(shù)學(xué)公式推導(dǎo)得到目的基因=2-ΔΔCt，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對(duì)照組，可直接得到目的基因相對(duì)管家基因的量，不必制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對(duì)簡(jiǎn)便省時(shí)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì)：實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)目的基因擴(kuò)增數(shù)量，定量估計(jì)樣本中目的基因初始量，并通過(guò)熒光信號(hào)展示清晰的PCR過(guò)程；操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短；重復(fù)性和特異性良好、靈敏度很高；在封閉的體系中完成熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，降低了被污染的可能性。該技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，如對(duì)mRNA表達(dá)的研究、各種基因定量分析、點(diǎn)突變分析和等位基因分析、單核苷酸多態(tài)性分析以及對(duì)各種傳染病進(jìn)行定性、定量分析[2]等。

2 主要實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法

2.1DNA結(jié)合染料法SYBRGreen Ⅰ等染料可與雙鏈DNA相結(jié)合，在紫外線的激發(fā)下發(fā)出熒光，游離時(shí)在紫外線的激發(fā)下發(fā)出的熒光信號(hào)極低。在PCR體系中加入DNA結(jié)合染料，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光染料與逐漸增多的雙鏈DNA結(jié)合，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，因此能夠通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系中目的基因擴(kuò)增數(shù)量[1-3]。DNA結(jié)合染料可同時(shí)與特異性和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物(主要為引物二聚體)相結(jié)合，影響定量結(jié)果的可靠性。為消除此類影響，可進(jìn)行熔融曲線分析(Melting curve analysis)區(qū)分特異性產(chǎn)物和非特異性產(chǎn)物。SYBRGreen I是當(dāng)前使用最普遍的熒光染料，與雙鏈DNA具有高度的親和力[4]。EvaGreen是第三代雙鏈DNA結(jié)合染料，相比SYBRGreen Ⅰ染料更加穩(wěn)定和靈敏，對(duì)富含AT和富含CG的DNA序列均具有相近的親和力；在PCR體系中允許加入更高濃度的EvaGreen染料，產(chǎn)生的熒光信號(hào)更加穩(wěn)定，在熔融曲線中產(chǎn)生的峰更尖，適用于高分辨率熔融曲線分析(High resolution melting curve analysis)[5]。

2.2TaqMan探針?lè)?TaqMan探針是當(dāng)前使用最廣泛的水解熒光探針，其5′端標(biāo)記了熒光發(fā)射分子(Fluorescence Reporter Molecule)，3′端標(biāo)記了熒光淬滅分子(Fluorescence Quencher Molecule)，當(dāng)TaqMan水解探針處于游離狀態(tài)時(shí)，兩端的熒光分子相互靠近，在紫外線的激發(fā)下熒光被吸收，無(wú)法被熒光探測(cè)器檢測(cè)到。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，TaqMan探針與目的基因發(fā)生特異性結(jié)合，5′端的熒光發(fā)射分子被DNA合成酶水解，在空間上脫離了熒光受體分子的影響，在紫外線的激發(fā)下產(chǎn)生熒光，并被熒光信號(hào)探測(cè)器所捕獲[6]，通過(guò)絕對(duì)定量或相對(duì)定量的方式對(duì)樣本核酸量和擴(kuò)增片段數(shù)量進(jìn)行定量估計(jì)?？赏ㄟ^(guò)對(duì)不同基因型的病毒設(shè)計(jì)特異性探針，并在不同的探針上標(biāo)記不同的熒光分子，建立多重?zé)晒釶CR來(lái)對(duì)病毒進(jìn)行分型檢測(cè)[7]。

近年來(lái)出現(xiàn)在TaqMan探針的3′或5′端連接MGB配體來(lái)提高探針靈敏度和特異度的方法。MGB(Minor groove binding)配體是一種三肽分子，能選擇性地與富含AT兩種堿基的雙鏈DNA螺旋小溝發(fā)生非共價(jià)結(jié)合。MGB探針的一端以非熒光淬滅分子(Non-fluorescent Quencher Molecule)代替熒光淬滅分子，減少了背景熒光信號(hào)強(qiáng)度。MGB探針與靶基因的結(jié)合更加穩(wěn)定，MGB能提高探針的Tm(Melting Temperature，熔融溫度)值，因此能夠?qū)⑻结樤O(shè)計(jì)地更短，有利于針對(duì)病毒的多種基因型的相同位點(diǎn)而設(shè)計(jì)通用探針[1]；同時(shí)使探針能夠分辨一個(gè)堿基的差別，當(dāng)存在一個(gè)堿基不同時(shí)就無(wú)法在一定波長(zhǎng)紫外線的激發(fā)下發(fā)出熒光，因此能夠進(jìn)行基因點(diǎn)突變的檢測(cè)；MGB探針發(fā)生錯(cuò)配的概率更少，減少了非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)。MGB探針已被應(yīng)用于多重病原體檢測(cè)、病毒載量分析、基因表達(dá)、等位基因分型以及SNP檢測(cè)等領(lǐng)域中。

2.3分子信標(biāo)法 分子信標(biāo)(Molecule Beacon)是呈現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的頸環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，5′端標(biāo)記有熒光發(fā)射分子，3′端標(biāo)記有熒光淬滅分子。分子信標(biāo)呈現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，熒光發(fā)射分子與淬滅分子相互靠近而不能在紫外線的激發(fā)作用下發(fā)出熒光[6]。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熱循環(huán)溫度達(dá)到分子信標(biāo)的解鏈溫度，構(gòu)象發(fā)生改變，與靶基因相結(jié)合而完全伸展成線性分子，熒光報(bào)告分子和熒光淬滅分子在空間上足夠的分離，在紫外線的激發(fā)下發(fā)出熒光。其定量原理與TaqMan探針相同。分子信標(biāo)能夠區(qū)分只有一個(gè)核苷酸差異的不同DNA序列，適用于點(diǎn)突變的檢測(cè)。

2.4核酸類似物法 LNA(Locked Nucleic Acids，鎖定核酸)是雙RNA聚合的類似物，其2′位的氧原子與核糖4′碳原子形成亞甲基的橋鍵[8]。在寡核苷酸鏈(如TaqMan探針、分子信標(biāo)等)中摻入LNA分子，可以增加寡核苷酸鏈的Tm值，提高其穩(wěn)定性，與靶基因結(jié)合具有很高的特異性。LNA-分子信標(biāo)和LNA-探針已被應(yīng)用于結(jié)核桿菌的SNP檢測(cè)、幽門螺旋桿菌的檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)、等位基因的特異性突變檢測(cè)以及HBV病毒的的定量檢測(cè)等領(lǐng)域中。PNA(Peptide nucleic acids)是電中性DNA類似物，其磷酸戊糖骨架被N-2氨乙基甘氨酸代替，標(biāo)記噻唑橙等熒光分子與雙鏈DNA和RNA結(jié)合，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。ZNA(Zip nucleic acids)是攜帶精胺衍生物的人工合成寡核苷酸鏈，能夠放置在探針的3′端、5′端或中間，通過(guò)減少核酸之間的靜電斥力來(lái)增加與靶基因結(jié)合的穩(wěn)定性[1]。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR在臨床快速診斷、治療效果的監(jiān)測(cè)和評(píng)估、發(fā)現(xiàn)傳染源、疾病流行暴發(fā)的處置等臨床和公共衛(wèi)生領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR已被應(yīng)用于乙肝病毒、登革熱病毒、流感病毒、水皰口炎病毒等病毒性病原體的核酸檢測(cè)，在病毒性傳染病的快速診斷、病毒分型、不同病毒的鑒別檢測(cè)、耐藥突變體檢測(cè)、新發(fā)傳染病病原體快速檢測(cè)等方面發(fā)揮了重要作用。

3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR在乙肝診斷、乙肝病毒和耐藥突變體檢測(cè)等的應(yīng)用 乙肝病毒感染是造成急慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要原因之一，在全球大約有20億人感染乙肝病毒，超過(guò)350萬(wàn)人是乙肝病毒的長(zhǎng)期攜帶者[9]，乙肝病毒給全球帶來(lái)了沉重的疾病負(fù)擔(dān)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR廣泛應(yīng)用于乙肝病毒檢測(cè)、乙肝診斷、治療過(guò)程監(jiān)測(cè)等，雜交探針?lè)ê蚑aqMan探針?lè)ㄊ侵饕椒╗10]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR在乙肝病毒檢測(cè)中的應(yīng)用主要有以下幾個(gè)方面：1)對(duì)臨床患者進(jìn)行確診，并對(duì)所感染乙肝病毒的型別進(jìn)行區(qū)分。乙肝病毒存在多種基因型，各基因型間的遺傳序列差異較大，Welzel等[11]根據(jù)各基因型病毒全基因序列比對(duì)設(shè)計(jì)引物和探針，能夠同時(shí)測(cè)定乙肝病毒的A-G基因型。Wang等[12]應(yīng)用LNA探針?lè)z測(cè)HBV，相比于普通TaqMan探針?lè)ň哂懈叩撵`敏度，更廣的線性檢測(cè)范圍和更高效的擴(kuò)增效率，所需探針濃度更低。2)在耐藥突變體檢測(cè)中的應(yīng)用?；颊咴陂L(zhǎng)期使用拉米夫定抗乙肝病毒治療過(guò)程中，乙肝病毒P基因區(qū)的YMDD(酪氨酸-Y，蛋氨酸-M，天門冬氨酸-D，)基因序列容易發(fā)生變異而對(duì)拉米夫定耐藥，形成YVDD(纈氨酸-V)、YSDD(絲氨酸-S)、YIDD(異亮氨酸-I)耐藥突變體。Cane[13]等最早在1999年針對(duì)P基因區(qū)容易發(fā)生耐藥突變的密碼子550序列周圍設(shè)計(jì)4種雜交探針，包含了針對(duì)野生型(密碼子550為ATG)的探針和針對(duì)YMDD突變型(密碼子550為GTG或ATT)的探針，能夠?qū)δ退幫蛔凅w進(jìn)行快速檢測(cè)。Geng[14]等使用雙TaqMan-MGB探針對(duì)拉米夫定耐藥乙肝病毒進(jìn)行檢測(cè)，TaqMan-MGB探針能檢出至少一個(gè)堿基的差別，靈敏度和特異度很高。Yang[15]比較了實(shí)時(shí)熒光定量PCR和PCR產(chǎn)物測(cè)序、焦磷酸測(cè)序3種技術(shù)在YMDD突變體檢測(cè)中的應(yīng)用，結(jié)果顯示實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度更高、檢測(cè)時(shí)間更短。Shih[16]等通過(guò)全基因序列比對(duì)，在高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和雜交探針，通過(guò)熔融曲線分析，根據(jù)不同突變體所產(chǎn)生的特異性Tm值的熔融曲線，來(lái)對(duì)YMDD、YIDD、YVDD進(jìn)行區(qū)分；同時(shí)還能以標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)病毒載量進(jìn)行定量，用于監(jiān)測(cè)抗病毒治療效果和監(jiān)測(cè)耐藥突變體的發(fā)生，對(duì)于乙肝的抗病毒治療有重要的臨床意義。Ntziora[17]等采用了分子信標(biāo)技術(shù)檢測(cè)耐藥突變體，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法在突變體載量小于總病毒載量的25%時(shí)無(wú)法發(fā)揮作用，而分子信標(biāo)技術(shù)在低病毒載量乙型肝炎病毒耐藥突變體檢測(cè)中發(fā)揮了很好的效果。第三是對(duì)某些核酸標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。共價(jià)閉環(huán)DNA(Covalently Closed Circular DNA，cccDNA)是乙肝病毒復(fù)制的起始模板，在血液中檢測(cè)到乙肝病毒DNA的出現(xiàn)表示乙肝病毒在體內(nèi)正在進(jìn)行活躍復(fù)制，是慢性乙肝的相關(guān)重要生物標(biāo)志物，但其在血漿中的來(lái)源尚不完全清楚。已有研究[18]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)慢性乙肝患者的血漿樣本cccDNA進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)限為15個(gè)拷貝，靈敏度很高，大部分的慢性乙肝患者血漿樣本能被檢出cccDNA的存在，用于慢性乙肝診斷。

3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR在登革熱病毒檢測(cè)中的應(yīng)用 登革熱病毒為蚊媒傳染性病毒，屬于黃熱病毒科，分為1-4型血清型[19]，當(dāng)前主要檢測(cè)技術(shù)包括RT-PCR檢測(cè)病毒核酸和使用ELISA檢測(cè)中和抗體，PCR技術(shù)是當(dāng)前唯一能夠判定病毒血清型的方法[20]。Taqman法[21]和SYBRGreen I法[19]是最早應(yīng)用于急性感染血清樣本中登革熱病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，設(shè)計(jì)針對(duì)4種血清型的引物，特異性檢測(cè)登革熱病毒的4種血清型。有研究建立多重檢測(cè)體系，使用4種標(biāo)記不同熒光分子的TaqMan特異性探針在單一體系中完成檢測(cè)，達(dá)到對(duì)登革熱病毒4種血清型鑒別診斷的目的[22]。

3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR在流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用 實(shí)時(shí)熒光定量PCR已被應(yīng)用于流感病毒檢測(cè)。甲型流感病毒曾在世界范圍內(nèi)造成多次大流行，2009年在全球發(fā)生了甲型H1N1流感大流行，之后H1N1病毒的檢測(cè)能力得到日益提高。Ellis[23]做了對(duì)H1N1檢測(cè)的4種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的對(duì)比評(píng)估。Song HO等[24]建立Polymeric LabChip實(shí)時(shí)熒光定量PCR，使用了針對(duì)H1N1病毒H基因的新型特異性引物，具有成本低、靈敏度高、特異性高、檢測(cè)速度快、檢測(cè)設(shè)備重量輕等特點(diǎn)。

甲型流感病毒分為包括H1N1在內(nèi)的很多高致病性亞型，如：H3N2、H5N1、H7N9，2004年Stone等[25]使用特異性雜交探針的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行H1N1和H3N2兩種甲型流感病毒亞型的分型檢測(cè)。Wang等[26]開(kāi)發(fā)了多重實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)4種熒光信號(hào)，來(lái)對(duì)甲型流感病毒的4種亞型(H1、H3、H7、H9)進(jìn)行鑒別檢測(cè)，檢測(cè)方法采用SYBRGreen或者TaqMan技術(shù)，在針對(duì)4種亞型的H基因的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在每種探針兩端分別標(biāo)記不同的熒光集團(tuán)和熒光淬滅集團(tuán)，達(dá)到分型鑒別檢測(cè)的目的。Zhang等[27]建立了MGB多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)H5亞型禽流感進(jìn)行檢測(cè)。

流感病毒分為甲、乙、丙三型，Wu等[28]也應(yīng)用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)甲型、乙型流感病毒進(jìn)行鑒別診斷。同時(shí)有研究應(yīng)用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別檢測(cè)很多導(dǎo)致臨床癥狀類似的病原體，如流感病毒和呼吸道合胞病毒的多重檢測(cè)[29-30]，用于引起呼吸道疾病暴發(fā)流行的病原體快速鑒別，對(duì)于呼吸道傳染性疾病防控具有重要意義。

3.4實(shí)時(shí)熒光定量 PCR在狂犬病病毒和狂犬病病毒屬檢測(cè)中的應(yīng)用 狂犬病病毒(Rabies Virus，RABV)是狂犬病的主要病原體，屬于狂犬病病毒屬、彈狀病毒科，核酸為單股負(fù)鏈RNA，全長(zhǎng)約為12 kb，N、L基因?yàn)楦叨缺Ｊ匦蛄?，其他部分仍然具有高度的遺傳多樣性；狂犬病病毒是狂犬病病毒屬中地理分布范圍、宿主分布范圍最廣的病毒，幾乎能感染包括人在內(nèi)的所有哺乳動(dòng)物?？袢∈且环N急性病毒性腦炎，病死率幾乎為100%，與其他某些病毒引起的急性腦炎癥狀很難區(qū)分，快速可靠的臨床診斷非常重要[31]?？袢〔《緦?Lyssavirus)屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)，ICTV(國(guó)際病毒分類委員會(huì)，International Committee of Taxonomy Virus)明確了狂犬病病毒屬的3個(gè)譜系：譜系Ⅰ包括RABV, Aravan virus[ARAV]、Khujand virus[KHUV]、Bokeloh bat lyssavirus[BBLV]、Duvenhage virus[DUVV]、European bat lyssavirus 1[EBLV-1]、European bat lyssavirus 2[EBLV-2]，Australian bat lyssavirus[ABLV]和Irkut virus[IRKV]；譜系Ⅱ包括Mokola virus[MOKV]，Shimoni bat virus[SHIBV]和 Lagos bat virus[LBV]；譜系Ⅲ包括Ikoma lyssavirus[IKOV]、West Caucasian bat virus[WCBV]和Lleida bat virus[LLBV]；另外還有尚未明確分類的在西班牙蝙蝠中分離的LLEBV(Lleida bat lyssavirus)。當(dāng)前又發(fā)現(xiàn)了新的病毒——Gannoruwa bat lyssavirus。歐洲蝙蝠病毒等病毒的感染均有可能造成狂犬病死亡病例，因此也被稱為狂犬病相關(guān)病毒(Rabies-related Viruses)，狂犬病病毒屬的檢測(cè)對(duì)于狂犬病預(yù)防控制同樣重要。

3.4.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR在狂犬病病毒檢測(cè)中的應(yīng)用 當(dāng)前狂犬病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是直接免疫熒光法(Direct Fluorescent Antibody Test，DFA)，靈敏度和特異度很高，但是存在很多局限性，如適用于檢測(cè)腦組織樣本，對(duì)腐敗樣本和唾液等非神經(jīng)樣本檢出效果不好，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，需要熒光顯微鏡，不能用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等。已有研究應(yīng)用傳統(tǒng)RT-PCR檢測(cè)狂犬病病毒，包括巢式、半巢式RT-PCR，相比于金標(biāo)準(zhǔn)具有更高的靈敏度和特異度，對(duì)樣本類型限制較少其局限性有對(duì)于大量樣本工作負(fù)擔(dān)較重，同時(shí)存在交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR克服以上局限性，能夠?qū)颖静《据d量進(jìn)行定量，檢測(cè)時(shí)間更短，減少污染的風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果更可靠。

Nagaraj等[32]最早使用SYBRGreen Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了21份陽(yáng)性狂犬病患者唾液樣本，設(shè)計(jì)了位點(diǎn)為64-82和201-183的一對(duì)引物，熒光曲線圖顯示大多數(shù)陽(yáng)性樣本Ct值在26-19個(gè)循環(huán)之間，少數(shù)樣本的Ct值超過(guò)了35個(gè)循環(huán)為非特異性熒光(引物二聚體)，判斷熒光信號(hào)是否來(lái)源于特異性產(chǎn)物需進(jìn)行熔融曲線分析(Melting curve analysis)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行重新升溫并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，如果熒光信號(hào)來(lái)源于特異性產(chǎn)物則會(huì)出現(xiàn)一個(gè)很高的尖峰，結(jié)果為陽(yáng)性樣本在78 ℃出現(xiàn)尖峰，表明有特異性產(chǎn)物；某些樣本出現(xiàn)小的峰值表示為非特異性產(chǎn)物如引物二聚體。與傳統(tǒng)巢式RT-PCR對(duì)相同樣本檢測(cè)結(jié)果相比較，顯示實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有更高的靈敏度(75%)，并能在更短的時(shí)間內(nèi)完成對(duì)狂犬病患者唾液樣本檢測(cè)。SYBRGreen Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR也被用于對(duì)感染動(dòng)物的死前檢測(cè)，Saengseesom等[33]研究結(jié)果表明大部分唾液樣本能夠檢出狂犬病病毒，腦脊髓液相比于唾液較難檢出。

狂犬病病毒核酸檢測(cè)主要應(yīng)用TaqMan法，探針容易和模板序列發(fā)生錯(cuò)配，Hughes等[7]發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配發(fā)生數(shù)量會(huì)嚴(yán)重影響PCR擴(kuò)增。Supaporn等[34]開(kāi)始使用TaqMan技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物的口腔粘膜拭子、毛囊組織，結(jié)果顯示口腔粘膜拭子檢測(cè)靈敏度大于80%，毛囊組織的檢測(cè)靈敏度為60%。Mani等[35]應(yīng)用TaqMan技術(shù)對(duì)唾液、皮膚組織、腦脊髓液和血清進(jìn)行被感染動(dòng)物的死前檢測(cè)，檢出率很高。

Martin等[36]以N基因和L基因?yàn)榘谢蚍謩e設(shè)計(jì)引物和探針，構(gòu)建了兩套TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系檢測(cè)RABV，采用絕對(duì)定量的方式，通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒合成標(biāo)準(zhǔn)RNA序列，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)RNA序列10倍倍比稀釋測(cè)定Ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。兩種檢測(cè)體系對(duì)非洲本地RABV分離株均能檢出，與MOKV、LBV等狂犬病病毒屬的其他病毒無(wú)交叉反應(yīng)，特異性均為100%，相比于傳統(tǒng)RT-PCR減少工作負(fù)擔(dān)和檢測(cè)時(shí)間；基于L基因的PCR反應(yīng)體系具有更優(yōu)秀的表現(xiàn)，檢測(cè)限是0.00 067 TCID50/mL，為傳統(tǒng)半巢式RT-PCR的萬(wàn)分之一，因此可用于檢測(cè)病毒載量較少的動(dòng)物唾液等樣本，對(duì)尚存活患者臨床樣本(唾液、皮膚組織、腦脊液)檢測(cè)中檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果完全一致，并且相比于基于N基因的PCR反應(yīng)體系具有更高的靈敏度，可作為人間狂犬病的診斷技術(shù)。

3.4.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR在狂犬病病毒屬檢測(cè)中的應(yīng)用 狂犬病病毒屬具有高度遺傳多樣性，開(kāi)發(fā)單一、方便使用的診斷技術(shù)很困難。金標(biāo)準(zhǔn)DFA以及分子生物學(xué)方法，如RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，目前都不能完全對(duì)狂犬病病毒屬的所有病毒進(jìn)行快速檢測(cè)。

Elizabeth[37]最早使用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了狂犬病病毒屬的6種基因型，以JW12為逆轉(zhuǎn)錄引物，以JW6(DPL)/JW6(M)/JW6(E) 混合引物為PCR擴(kuò)增引物；N基因是進(jìn)行病毒分型并且是最保守的序列，因此以N基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)均標(biāo)記了FAM熒光報(bào)告分子和TRAMA熒光淬滅分子的8種特異性探針(TQM1(ac)、TQM2～6)，探針的特異性很高，某一種病毒的特異性探針在其他基因型檢測(cè)中不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，能夠在單一反應(yīng)體系中對(duì)狂犬病病毒屬的6種基因型進(jìn)行檢測(cè)。Coertse[38]等開(kāi)發(fā)了使用單一探針(620lyssa)的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系對(duì)狂犬病病毒屬基因1-4型(RABV、LBV、MOKV、DUVV)進(jìn)行檢測(cè)，以CVS為標(biāo)準(zhǔn)RNA作為陽(yáng)性對(duì)照，以相比β-actin擴(kuò)增效率更加穩(wěn)定可靠的18s rRNA為內(nèi)參基因作為內(nèi)對(duì)照，靈敏度高于巢式RT-PCR 1 000倍。Ashutosh[39]設(shè)計(jì)了新的熒光定量PCR——LN34法，檢測(cè)所有狂犬病病毒和另外的13種具有代表性的狂犬病相關(guān)病毒，以N基因的高保守非編碼序列和部分編碼序列為靶基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，并將探針鏈接LNA和MGB分子，能夠提高探針的熔解溫度(Melting Temperature，Tm值)，減少非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增；兩種探針具有相近的靈敏度和特異度，MGB探針能夠識(shí)別探針靶基因的單個(gè)堿基的變化，而LNA探針能夠允許出現(xiàn)單個(gè)堿基的錯(cuò)配，因此LNA-探針更適合于更廣范圍的狂犬病相關(guān)病毒的檢測(cè)。

多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR已經(jīng)被應(yīng)用于狂犬病病毒屬中不同病毒的鑒別檢測(cè)。Wakeley[40]等首次開(kāi)發(fā)了TaqMan多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)狂犬病病毒、歐洲蝙蝠病毒-1/2進(jìn)行分型檢測(cè)，通過(guò)識(shí)別3種基因型的保守序列，設(shè)計(jì)了通用型引物N165-146，并設(shè)計(jì)3種被標(biāo)記了不同熒光報(bào)告/淬滅分子(FAM/TAMRA、HEX/Blackhole Quencher 1、Cy5/Blackhole Quencher 2)的特異性TaqMan探針(LysGT1、LysGT5、LysGT6),分別對(duì)應(yīng)3種病毒，不同的熒光分子在波長(zhǎng)不同的紫外線照射下產(chǎn)生熒光，達(dá)到鑒別檢測(cè)的目的，同時(shí)設(shè)立了β-actin內(nèi)參基因以排除樣品完整性、核酸提取過(guò)程所帶來(lái)的系統(tǒng)誤差。Deubelbeiss[41]等在Wakeley所設(shè)計(jì)的2種探針的基礎(chǔ)上新加了7種探針，在兩套探針體系下能對(duì)狂犬病病毒屬的9種基因型進(jìn)行分型檢測(cè)，并以Sandai Virus為內(nèi)參基因。

Hayman[42]等N165-146引物基礎(chǔ)上建立了只使用兩種引物的SYBRGreen Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR，能檢測(cè)當(dāng)時(shí)已發(fā)現(xiàn)的11種狂犬病相關(guān)病毒，其靈敏度是傳統(tǒng)半巢式RT-PCR的200倍。SYBRGreenⅠ檢測(cè)法存在出現(xiàn)假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)，而TaqMan法的靈敏度相對(duì)較低，而且要設(shè)計(jì)多種特異性探針，使用兩種技術(shù)相結(jié)合能夠有效提高病毒檢測(cè)范圍和靈敏度[43]。

3.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR在其他病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR在寨卡、水皰口炎病毒等的檢測(cè)中也被廣泛應(yīng)用。已有研究建立了水皰口炎病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法，如花群義[44]等建立的TaqMan法對(duì)印第安型和新澤西型進(jìn)行檢測(cè)；Tolardo等[45]建立的SYBRGreen檢測(cè)法，能夠檢測(cè)水皰口炎病毒屬的Piry、Carajas、Alagoas、Indiana 4種病毒種，并對(duì)黃病毒、甲病毒等不會(huì)發(fā)生交叉污染，其中Priy、Alagoas、Indiana均對(duì)人致病。Kate[46]等建立了MGB實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)和分型Indiana病毒1-3型和New Jersey病毒，以L基因7 230-7 465位點(diǎn)為靶基因設(shè)計(jì)通用引物和特異性MGB探針，MGB能夠提高探針的退火溫度和特異性，因此能夠在單一體系中進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，同時(shí)以159個(gè)自然感染的牛上皮細(xì)胞樣本進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)相一致，同時(shí)還能夠進(jìn)行分型，具有一定的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)。

已有少數(shù)研究建立了某些新發(fā)病毒性病原體如寨卡病毒的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法[47-50]，但是大部分研究并沒(méi)有覆蓋寨卡病毒的大部分株系，同時(shí)寨卡病毒與黃熱病毒、登革熱病毒、腦炎病毒等具有同源性，引物設(shè)計(jì)不當(dāng)會(huì)降低檢測(cè)方法的特異性。

4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR在病毒檢測(cè)中的意義及展望

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種成熟的核酸快速檢測(cè)技術(shù)，具有良好的應(yīng)用前景，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于傳染性疾病病原體的快速檢測(cè)，為傳染性疾病的診斷提供實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR已經(jīng)被應(yīng)用于病毒的定性檢測(cè)，病毒各基因型和基因亞型的分型檢測(cè)，類似病毒之間的鑒別檢測(cè)，用于提供傳染性疾病的臨床診斷證據(jù)，了解病毒的流行狀況，監(jiān)測(cè)病毒的流行型別，發(fā)現(xiàn)病毒傳染源，對(duì)于制定有針對(duì)性病毒性傳染性疾病的防控策略和措施具有重要意義。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)能夠檢測(cè)感染患者和動(dòng)物組織、體液樣本的病毒載量，檢測(cè)病毒耐藥突變體以及患者體內(nèi)的感染標(biāo)志物等，對(duì)于監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)病毒的耐藥狀況，跟蹤治療進(jìn)程，評(píng)估疫苗預(yù)防效果或藥物治療效果等具有重要的臨床意義。

在狂犬病診斷中，可應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)患者的唾液、腦組織等樣本進(jìn)行檢測(cè)，為狂犬病診斷提供證據(jù)；還能夠?qū)Ρ桓腥緞?dòng)物進(jìn)行死前檢測(cè)，如對(duì)低病毒載量的唾液、腦脊液、血清等樣本進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需提取動(dòng)物腦組織進(jìn)行DFA檢測(cè)，靈敏度很高，檢測(cè)速度快，具有很大的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)?？袢〔《緦僦邪?4種病毒，均有造成人間狂犬病的可能，而狂犬病疫苗并非對(duì)所有狂犬病相關(guān)病毒都有預(yù)防效果。多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在狂犬病診斷中應(yīng)用廣泛，使用單一方法對(duì)狂犬病病毒屬中的大部分病毒進(jìn)行檢測(cè)成為可能，且檢測(cè)方法高效、快速、靈敏，具有替代金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行狂犬病診斷的潛力，具有一定的臨床意義；同時(shí)在國(guó)際交流日益頻繁的今天，對(duì)于防控外來(lái)病毒具有一定的國(guó)際意義。大部分病毒都有特定的流行區(qū)域，如歐洲地區(qū)主要流行RABV和歐洲蝙蝠病毒-1/2，其主要感染和傳播動(dòng)物種類并不相同，對(duì)這些流行病毒進(jìn)行分型診斷，從而了解某地區(qū)的主要流行病毒的型別，加強(qiáng)其主要感染和傳播動(dòng)物的管理，對(duì)于狂犬病的防控具有重要意義。

本文主要針對(duì)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR在病原檢測(cè)方面的應(yīng)用，在基因表達(dá)定量、高度多態(tài)性HLA位點(diǎn)的識(shí)別、等位基因識(shí)別、基因甲基化檢測(cè)、遺傳性疾病檢測(cè)等領(lǐng)域也被廣泛應(yīng)用，將此技術(shù)與狂犬病病毒等病原體的復(fù)制、表達(dá)、突變、致病毒力等方面相結(jié)合，探索病毒致病機(jī)制，研究抗病毒治療方法都需要進(jìn)一步研究。

(本文工作在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所完成，在此謹(jǐn)向幫助我的各位老師和同學(xué)致謝。)