石 萍 魯增輝 游華建 陳仕江

重慶市中藥研究院，重慶 400065

龜甲膠(Testudinis Carapacis et Plastri Colla,TCPC)為龜科動物烏龜Chinemysreevesii(Gray)的背甲和腹甲經(jīng)過水煎煮、濃縮而制成的固體膠，歷版《中國藥典》均有收載，為中國名貴中藥，始載于《本草崇源》，屬甲膠范疇，龜甲膠性涼，味咸、甘，歸肝、腎、心經(jīng)，具有滋陰，養(yǎng)血止血之功效，主治陰虛潮熱、骨蒸盜汗、腰膝酸軟、血虛萎黃、崩漏帶下等[1]。根據(jù)歷代本草記載，龜甲膠為常用中藥的補(bǔ)虛藥物之一。

目前，國內(nèi)對動物膠類藥材的研究主要集中在阿膠及鹿角膠，對龜甲膠的研究十分匱乏，筆者通過查閱近15年有關(guān)龜甲膠研究報(bào)道，從龜甲膠的化學(xué)成分、藥理作用、臨床、真?zhèn)舞b定及質(zhì)量控制等方面進(jìn)行綜述，旨在為更好地保護(hù)利用龜甲膠提供數(shù)據(jù)和參考。

1 化學(xué)成分研究

目前，文獻(xiàn)資料顯示龜甲膠主要成分為蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸及微量元素等，其有效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。1.1 蛋白質(zhì)、多肽及氨基酸的含量測定 李春梅等[2]采用激光解析/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF MS)，對龜甲膠1500～13000Da區(qū)間蛋白質(zhì)、肽分布以及分子量進(jìn)行分析，并得到龜甲膠的蛋白質(zhì)/肽成分質(zhì)量指紋圖譜，該結(jié)果也可作為龜甲膠數(shù)字化質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)。除了對蛋白質(zhì)和肽的研究，有學(xué)者[3]也對龜甲膠氨基酸的含量進(jìn)行測定，并得到14種氨基酸含量(羥脯氨酸、絲氨酸、谷氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸)，其測定結(jié)果也可作為龜甲膠藥材的鑒別標(biāo)準(zhǔn)，為進(jìn)一步完善龜甲膠藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的數(shù)據(jù)參考。周維等[4]對龜甲的提取物(即龜甲膠經(jīng)水煎煮、濾過、濃縮、干燥后，并加輔料混合均勻后而制得的顆粒)中6種氨基酸(甘氨酸、L羥脯氨酸、L脯氨酸、瓜氨酸、丙氨酸、亮氨酸)的含量進(jìn)行測定。萬鳴等[5]對采自不同時(shí)間階段，來源于同一產(chǎn)地(湖北荊州)的龜甲進(jìn)行水煎提取處理后，測定龜甲膠的含氮量，并分析不同時(shí)間段的龜甲及不同部位(背甲和腹甲)的出膠率及含氮量，結(jié)果表明，不同時(shí)間采集龜甲對出膠得率和氮含量結(jié)果影響不大，出膠得率在11.10%～14.30%，氮含量在16.14%～17.08%；從不同部位如背甲和腹甲中提取龜甲膠，出膠率分別為13.43%和14.31%，含氮量分別為16.20%和16.31%。提示不同時(shí)間及不同部位對龜甲的出膠率及氮含量影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。1.2 微量元素及有害元素含量的測定 曹繼華等[6]對包括龜甲膠在內(nèi)的6味中藥進(jìn)行微量元素的測定，結(jié)果顯示，龜甲膠中含有鈣、鎂、鐵、鋅、磷、錳、銅、鍶等多種微量元素，并且鈣和鐵的含量要明顯高于其它兩種膠類藥材如鹿角膠和阿膠。有研究者對龜甲膠中有害元素的含量進(jìn)行測定，袁利杰等[7]利用微波消解-電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS)測定龜甲膠中6種有害元素(砷、銅、鉻、鉛、鎘、汞)的含量，王海波等[8]采用電感耦合等離子體光譜，對9批龜甲膠樣品中鉻元素的含量進(jìn)行測定，鉻含量在0.15～1.24 mg·kg-1之間。查閱我國歷版藥典及相關(guān)醫(yī)藥法規(guī)，尚未對龜甲膠中鉻元素及其它有害元素的含量及限度進(jìn)行規(guī)定，因此建立有害元素檢測的方法及含量的控制對安全用藥具有十分重要的意義。

2 藥理作用研究

2.1 促進(jìn)細(xì)胞增殖 藥理研究表明，龜甲膠通過上調(diào)或下調(diào)一系列基因的表達(dá)，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡，從而修復(fù)受損軟骨，最終延緩骨關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程。

林嘉輝等[9]選取3月齡豚鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，分別用龜甲膠、鹿角膠、鹽酸氨基葡萄糖(GHC)含藥血清和生理鹽水對其進(jìn)行干預(yù)，比較含藥血清對軟骨細(xì)胞的促增殖作用情況，并且采用QPCR檢測干預(yù)后軟骨細(xì)胞JNK及p38 MAPK基因的表達(dá)差異情況。結(jié)果表明，龜甲膠和鹿角膠均下調(diào)JNK及p38 MAPK基因的表達(dá)，從而減少JNK和p38 MAP在軟骨細(xì)胞內(nèi)的合成，進(jìn)而減少基質(zhì)降解，抑制細(xì)胞的凋亡，最終延緩骨關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)展，其中龜甲膠組抑制JNK和p38 MAPK基因的表達(dá)作用最強(qiáng)。陳澤華等[10]、陳炳藝等[11]也進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)，區(qū)別是選取的試驗(yàn)對象不同，為3月齡豚鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，檢測干預(yù)后軟骨細(xì)胞增殖情況，并采用SABC免疫組化檢測干預(yù)后軟骨細(xì)胞MKK的表達(dá)。結(jié)果表明，龜甲膠、鹿角膠均能顯著性上調(diào)膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MKK的表達(dá)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，修復(fù)受損軟骨、緩解骨關(guān)節(jié)炎。2.2 抑制細(xì)胞凋亡 李楠等[12-13]通過試驗(yàn)研究龜鹿二仙膠及其拆方對大鼠及豚鼠軟骨細(xì)胞Collagen-Ⅱ和GAG的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠全方可明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞Collagen-Ⅱ和蛋白多糖的表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，其作用明顯強(qiáng)于各個(gè)拆方，且君藥龜甲膠和鹿角膠的作用強(qiáng)于臣藥人參和枸杞的作用。該團(tuán)隊(duì)在后續(xù)試驗(yàn)中選取第三代4周齡SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，采用SNP誘導(dǎo)凋亡后，用免疫組化染色法以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測研究了龜鹿二仙膠及其拆方含藥血清對軟骨細(xì)胞bax、bcl-2的表達(dá)[14]，結(jié)果顯示，龜鹿二仙膠及其各個(gè)拆方均能上調(diào)bcl-2表達(dá)及下調(diào)bax的表達(dá)，即龜甲、鹿角、人參、枸杞均具有抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用，并且研究發(fā)現(xiàn)，君藥龜甲和鹿角較臣藥人參和枸杞有明顯加強(qiáng)抑制凋亡的作用。2.3 提高血清雌二醇(E2)水平 杜江等[15]研究表明，龜甲膠與鹿角膠在提高血清雌二醇(E2)濃度及促進(jìn)膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)Ⅱ型膠原表達(dá)方面具有顯著性的作用。李楠等[16]研究龜鹿二仙膠及其各個(gè)拆方對SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的影響，結(jié)果證實(shí)，龜甲和鹿角配伍人參可明顯提高血清雌二醇(E2)濃度水平，抑制關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞Collagen-Ⅱ的合成及增殖。

3 臨床研究

龜甲膠在臨床上主要用于滋陰養(yǎng)血、止血補(bǔ)血、益腎健骨等方面。

俞紅麗等[17]利用益血生膠囊(阿膠、鹿角膠、龜甲膠、白芍、當(dāng)歸等成分)治療48例缺鐵性貧血，治療3個(gè)月后，治療組復(fù)發(fā)率、不良反應(yīng)均低于對照組(P<0.05)。賽漢其其格[18]利用補(bǔ)腎固沖(熟地黃、制首烏、山茱萸、山藥、龜甲膠、生龍骨、牡蠣等)治療268例更年期宮血，治愈164例，好轉(zhuǎn)75例，總有效率達(dá)89.18%。陳淑萍[19]運(yùn)用補(bǔ)腎基本方(熟地黃、懷山藥、龜甲膠、鹿角膠等主要成分)治療功能性子宮出血35例，痊愈21例，顯效9例，好轉(zhuǎn)4例，總有效率高達(dá)97%。蔡忠鳳等[20]利用龜鹿補(bǔ)腎丸(龜甲膠、鹿角膠、菟絲子炒、淫羊藿、續(xù)斷等主要成分)治療陽萎86例，總有效率達(dá)100%。李文順等[21]運(yùn)用龜鹿二仙膠湯治療肝腎虧虛型膝骨性關(guān)節(jié)炎60例，總有效率98.3%，臨床療效明顯。

4 真?zhèn)舞b定及質(zhì)量控制研究

4.1 基原動物鑒定及質(zhì)量控制 中藥基原鑒定是中藥鑒定的基礎(chǔ)，確保應(yīng)用中藥材來源及品種的準(zhǔn)確性，對中藥材的繼承、研究、生產(chǎn)、開發(fā)利用均具有十分重要的意義[22]。

唐敏等[23]選取以巴西龜和中華草龜為來源的龜甲膠作為實(shí)驗(yàn)對象，采用超高效液相色譜-電噴霧四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法，并且以牛皮特征肽離子為檢測對象對兩種來源的龜甲膠進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，該方法可區(qū)別巴西龜龜甲膠和摻雜牛皮成分的龜甲膠，也可用于龜甲膠的質(zhì)量控制。彭婷婷等[24]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS)，以不同品種龜甲為原料分別熬制成龜甲膠，并測定其牛皮源的含量，結(jié)果表明，純草龜龜甲熬制的龜甲膠檢測結(jié)果為牛皮源陰性，摻雜巴西龜龜甲的龜甲膠檢測結(jié)果為牛皮源陽性，該方法可有效控制龜甲膠質(zhì)量。

4.2 幾種動物膠類藥材鑒定及質(zhì)量控制 目前，研究較多的動物膠類藥材有3種，即龜甲膠、鹿角膠和阿膠。殷學(xué)毅[25]選用包括龜甲膠在內(nèi)的3種動物膠類樣品，分別置于熱分析儀樣品室，在空氣氣氛下，以5℃/min的速度從20℃勻速升至550℃，獲得不同樣品的微商熱重(DTG)曲線和差熱分析(DTA)曲線，根據(jù)其曲線的特征差異進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示，利用熱分析方法可以將該幾種動物膠類藥材(龜甲膠、鹿角膠、阿膠)進(jìn)行區(qū)分鑒定。錢瑛等[26]將阿膠、龜甲膠、鹿角膠3種樣品，經(jīng)加熱、研磨粉碎后，放入同步熱分析儀樣品室中進(jìn)行熱分析鑒定，對每種樣品分別做3次有效生物學(xué)重復(fù)測定，將得到的原始數(shù)據(jù)取平均值后，做DTG、DTA數(shù)據(jù)分析表，并分析該方法與感官鑒定法、水試法、圓二色譜鑒定法的成功率。結(jié)果顯示，熱分析法能夠準(zhǔn)確并快速鑒定區(qū)別龜甲膠、阿膠、鹿角膠這3種膠類藥材，且具有直觀簡便、成功率高的優(yōu)點(diǎn)，能夠在中藥材鑒定中推廣并加以運(yùn)用。于海英等[27]采用高效液相色譜(HPLC)，建立東阿阿膠、龜甲膠脂溶性成分的指紋圖譜，為藥用動物膠類藥材的鑒別及質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

歷版中國藥典中，動物膠類藥材均無專屬性鑒別，且性狀描述較粗略，對膠類的真?zhèn)渭皟?yōu)劣很難做出客觀、準(zhǔn)確的判斷。因此對動物膠類中藥鑒定及質(zhì)量控制方面應(yīng)當(dāng)予以加強(qiáng)研究，確保動物膠類中藥及其制劑的質(zhì)量，保證用藥安全。

5 其他

林芳花等[28]將海螵鞘與龜甲膠藥材提取液添加至培養(yǎng)基中飼養(yǎng)果蠅，記錄果蠅產(chǎn)生F1代和F2代數(shù)量。結(jié)果顯示，龜甲膠和海螵蛸都能顯著性提高果蠅的繁殖力。

6 小結(jié)

龜甲膠為我國傳統(tǒng)滋補(bǔ)類名貴中藥，臨床療效明確。但其有效活性物質(zhì)尚不明確，因此，應(yīng)加強(qiáng)對龜甲膠活性物質(zhì)的挖掘以及對其質(zhì)量控制方法，對制備工藝的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相關(guān)研究，并在龜甲膠真?zhèn)舞b定研究方面應(yīng)當(dāng)予以加強(qiáng)，以期更有效地利用該藥材資源，確保用藥安全。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部) [S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:181.

[2]李春梅,王若光,王陸穎,等. 基于激光解析/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的中藥龜甲膠蛋白質(zhì)組分析[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,27(6):21-23,29.

[3]江東龍,陳芳,熊丹丹,等. 柱前衍生化HPLC法同時(shí)測定龜甲膠中14種水解氨基酸含量[J]. 藥物分析雜志,2015,35(10):1790-1795.

[4]周維,胡昌江,鐘磊,等. 一測多評法測定龜甲提取物中6種氨基酸的含量[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2016,30(6):57-61.

[5]萬鳴,嚴(yán)宜昌,高歡. 不同季節(jié)、部位龜甲的龜甲膠提取率與含氮量測定研究[J].湖北中醫(yī)雜志,2016,38(3):71-72.

[6]曹繼華,陳隨清,王正益,等.桔梗等中藥微量元素初探[J]. 廣東微量元素科學(xué),1999,6(11)：35-37.

[7]袁利杰,李云,鄭子棟,等. 微波消解-電感耦合等離子質(zhì)譜法測定龜甲膠中6種有害元素[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào),2014,30(4):578-580.

[8]王海波,申二永,宋漢敏,等. 微波消解-電感耦合等離子體光譜法測定龜甲膠中鉻的含量[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,28(4):378-379.

[9]林嘉輝,陳炳藝,龍美兵,等. 龜甲膠和鹿角膠含藥血清對豚鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞JNK及p38 MAPK基因表達(dá)的影響[J]. 中國中醫(yī)骨傷科雜志，2016,24(10)：1-4.

[10]陳澤華,林家輝,陳炳藝,等. 龜甲膠、鹿角膠含藥血清對豚鼠關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞MKK表達(dá)的影響[J]. 中國中醫(yī)骨傷科雜志,2015,23(9):5-11.

[11]陳炳藝,陳澤華,林嘉輝,等. 龜甲膠、鹿角膠調(diào)控MKK基因表達(dá)促進(jìn)豚鼠OA軟骨細(xì)胞增殖的研究[J]. 中國骨質(zhì)疏松雜志,2016,22(7):805-808.

[12]李楠,尹玉彪,雒煥生,等. 龜鹿二仙膠及其拆方對豚鼠軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白多糖合成的影響[J]. 中華中醫(yī)藥雜志,2011,26(11):2524-2528.

[13]李楠,雒煥生,趙詣,等. 龜鹿二仙膠湯及其拆方對大鼠軟骨細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響[J]. 中國中醫(yī)骨傷科雜志,2011,19(7):1-3.

[14]李楠,雒煥生,尹玉彪,等. 龜鹿二仙膠及其拆方含藥血清對硝普鈉誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞bax、bcl-2表達(dá)的影響[J]. 中國中醫(yī)骨傷科雜志，2012,20(1)：1-4.

[15]杜江,黃遠(yuǎn)鵬,李奕修,等. 龜鹿二仙膠及其拆方對去勢骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清雌二醇濃度及膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)的影響[J]. 中醫(yī)正骨,2013,25(3)：11-20.

[16]李楠,杜江,黃遠(yuǎn)鵬,等. 龜鹿二仙膠及其拆方對SD大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(6):1677-1680.

[17]俞紅麗,孫金明.益血生膠囊治療缺鐵性貧血48例[J].陜西中醫(yī)，2006,27(5):542-543.

[18]賽漢其其格.補(bǔ)腎固沖治療更年期功能失調(diào)性子宮出血268例臨床體會[J].光明中醫(yī),2008,23(1):50-51.

[19]陳淑萍. 以補(bǔ)腎為主治療功能性子宮出血35例療效觀察[J]. 光明中醫(yī),2008,23(2):198-199.

[20]蔡忠鳳,呂立生.龜鹿補(bǔ)腎丸治療陽萎86例[J].臨床軍醫(yī)雜志，2004,32(3):122.

[21]李文順,李楠,余丹丹,等. 龜鹿二仙膠湯治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的臨床研究[J]. 福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,15(6):30-32.

[22]張貴君，王晶娟. 中藥基原鑒定的科學(xué)內(nèi)涵[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，2011,26(1)：1-3.

[23]唐敏,嚴(yán)建業(yè),趙小芳,等. UPLC-ESI-QTOF-MS檢測巴西龜龜甲膠中牛皮特征肽的研究[J]. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2016,18(12):2165-2169.

[24]彭婷婷,江勛. 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測不同品種龜甲制龜甲膠的牛皮源成分[J]. 中國藥業(yè),2016,25(10):72-73.

[25]殷學(xué)毅. 阿膠、龜甲膠、鹿角膠的熱分析區(qū)分鑒定[J]. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,15(2):39-41.

[26]錢瑛,邢軍. 應(yīng)用熱分析鑒定阿膠、龜甲膠、鹿角膠臨床研究[J]. 遼寧中醫(yī)雜志,2014,41(9):1939-1941.

[27]于海英,周永妍,程秀民. 阿膠、龜甲膠中脂溶性成分的高效液相色譜指紋圖譜[J]. 色譜,2009,27(4):447-452.

[28]林芳花,鄭愛娥,李燕秋,等. 海螵蛸與龜甲膠對果蠅繁殖力影響的對比研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2016,27(12):2861-2862.