張飛燕，趙 玲，金 潔，王 蕓，呂龍寶,2*

(1.中國科學(xué)院昆明動物研究所，昆明 650000； 2.中國科學(xué)院昆明靈長類研究中心，昆明 650223)

實驗動物是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和條件，實驗動物的質(zhì)量直接影響眾多領(lǐng)域科學(xué)實驗的準(zhǔn)確性，也關(guān)系到實驗動物從業(yè)人員和動物實驗操作者的健康[1]。因此，實驗動物的質(zhì)量控制成為制約性要素，實驗動物的微生物、寄生蟲質(zhì)量控制顯得尤為重要。目前，實驗動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測國標(biāo)GB 14922.2-2011，針對細菌檢測推薦的方法是病原菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定，但耗時長，操作繁瑣，易受檢測人員的主觀判定干擾；針對病毒檢測主要采取血清學(xué)方法檢測，但對于一些動物病毒呈周期性病毒，在排毒的時候，體內(nèi)無抗體，通過血清學(xué)方法檢測，就易造成假陰性。針對寄生蟲檢測主要采用直接涂片法或飽和氯化鈉漂浮法，也受檢測人員的判定干擾。此外，實驗動物多采用群體飼養(yǎng)，易被各種易感病原所感染，從而導(dǎo)致疾病的爆發(fā)和流行，嚴重影響經(jīng)濟效益，并使公共衛(wèi)生遭到威脅[2]。因此，建立一種快速、敏感、易于標(biāo)準(zhǔn)化操作的檢測技術(shù)尤為重要。多重PCR是近年來興起的一種新型檢測手段，實現(xiàn)在同一反應(yīng)體系對多種病原微生物的檢測，或?qū)z傳病、癌基因、耐藥基因的分型鑒定，具有高效、快速、經(jīng)濟簡便等優(yōu)點，實現(xiàn)對實驗動物多種病原微生物或具體哪一型病原體感染的鑒別診斷，以及為一些人獸共患病原如猴B病毒的監(jiān)測提供強有力的保障，在臨床上具有很高的應(yīng)用價值[3]。筆者將多重PCR技術(shù)應(yīng)用在實驗動物疫病病原體的檢測綜述如下，并提出多重PCR未來應(yīng)用前景的展望。

1 多重PCR的原理及技術(shù)特點

多重PCR反應(yīng)原理與普通PCR反應(yīng)原理與試劑基本相同，通過模板DNA與引物之間的變性、退火和延伸三個步驟為一個循環(huán)，每次循環(huán)產(chǎn)生的DNA片段為下次循環(huán)的模板。多重PCR反應(yīng)就是在一個PCR反應(yīng)體系里，同時擴增多個核酸片段或同一核酸片段的不同區(qū)域。目前，有很多文獻對影響PCR反應(yīng)的質(zhì)量條件進行了討論，然而對影響多重PCR實驗的關(guān)鍵因素鮮有報道。多重PCR與單重PCR最大的不同就是多對引物，因此各引物之間的濃度搭配影響最大，其次是由于擴增多個目的DNA，因此在Mg2+、dNTP的用量上面都需要做一些調(diào)整。大量實驗研究報告也指出，影響多重PCR成功的主要因素是：多重PCR體系里不同基因的引物對濃度、退火溫度、底物濃度應(yīng)達到平衡。在最初進行多重PCR反應(yīng)時，需要先優(yōu)化單重PCR的引物濃度、底物濃度、退火溫度這三大重要因素，再對多重PCR體系里各引物對濃度比例、底物濃度、退火溫度探討。首先，多重PCR引物的設(shè)計必須滿足每對單引物的設(shè)計原則，根據(jù)靶基因設(shè)計的各引物對應(yīng)具有高度的特異性，引物長度為20 bp左右，引物的GC含量應(yīng)不小于35%，大于60%[4]；其次，多重PCR反應(yīng)體系里，各引物對的濃度很重要[5]。大部分文獻研究報道，在最初的多重PCR反應(yīng)體系里，需要不斷的優(yōu)化多重PCR各引物對濃度，各引物對的濃度搭配會影響某些基因的擴增量[6-7]。解決這一問題，需要改變反應(yīng)中各種引物的比例，增加“弱”基因的引物量，減少“強”基因的引物量[8]。退火溫度也是影響多重PCR反應(yīng)的一個重要參數(shù)，大部分學(xué)者經(jīng)驗表明多重PCR里的退火溫度要比單獨擴增時的退火溫度低4℃左右，退火溫度55℃左右，效果最優(yōu)[9]，并建議所有引物對的最適退火溫度要盡可能的相同，這樣有助于多重PCR選擇的退火溫度保證每對引物都有相同的擴增率[10]。也有學(xué)者提出，高的退火溫度使基因的擴增量減少，盡管可用延長退火和延伸時間來解決這一問題。也有文獻報道指出，多重PCR實驗中，通過增長延伸時間能提高PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。Henegariu等[11]研究報道，在一個X、Y染色體引物同時擴增實驗中，通過增加延伸時間，發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量也增加了，同時試圖增加一個反應(yīng)體系擴增4個Y 染色體上的基因的延伸時間，也發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量增加。對于dNTP濃度，大量實驗研究證明，使用dNTP 濃度較低(最低50 μmol/L)，不抑制擴增，但會使擴增產(chǎn)物量減少；dNTP 濃度大于400 μmol/L時，擴增被迅速抑制[12-14]。另外，也有研究報道緩沖液中dNTP、MgCl2、KCl濃度的平衡，也影響著擴增的效率[15]。有研究指出，Mg2+能提高Taq DNA 聚合酶的活性，能提高擴增效率；同時指出長片段的擴增引物在低鹽濃度下擴增效率更高好，短片段的擴增引物在高鹽濃度下擴增效率更好[16]。此外，dNTP母液避免反復(fù)凍融。最后，對于反應(yīng)體系中佐劑的使用，大部分學(xué)者認為在反應(yīng)體系里加DMSO和甘油(參考范圍為：5%～10% (V/V))，可提高產(chǎn)物量和特異性[17]。一部分學(xué)者認為，加入0.8 μg/ μL BSA能更好的提高PCR擴增效率[18]。然而，也有反對的聲音，在反應(yīng)體系里加DMSO 會影響實驗結(jié)果。至于選擇什么樣的佐劑提高多重PCR擴增效率，有待更深入的研究。

多重PCR具有高效性，在同一PCR反應(yīng)體系能同時檢出多種病原微生物，或進行基因分型，只需要動物的一滴血，一根毛發(fā)或組織分泌物就可檢測多種病原體。此外，多重PCR具有系統(tǒng)性，多重PCR適用于病毒、腸道細菌等多種混合病原體的檢測，理論上只要條件允許，引物對的數(shù)量可以不限，目前有擴增9條目的片段的記錄[19]。但該技術(shù)需要對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行多次優(yōu)化。另外，多重PCR技術(shù)能在同一反應(yīng)體系快速鑒別診斷實驗動物多種病原體的混合感染，具有方便、快速、經(jīng)濟適用的優(yōu)點，能及時為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。

2 多重PCR在細菌、真菌混合感染檢測中的應(yīng)用

目前我國實驗動物微生物等級及監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)GB 14922.2-2011，針對豚鼠、地鼠、兔、犬和猴；清潔級以上小鼠、大鼠病原菌檢測主要采用傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)、鏡檢、生化鑒定，此種方法費時費力。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，多重PCR技術(shù)可以同時對這幾種病原菌進行檢測，具有高靈敏度、高效、低成本等優(yōu)點。

祝巖波等[20]建立了金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌多重PCR檢測方法，對76份感染的實驗動物糞便標(biāo)本進行檢測，結(jié)果表明建立的多重PCR方法對每種病原菌DNA最低檢測質(zhì)量能達到10 pg。王鵬飛等[21]建立了金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體多重PCR檢測方法，該方法對三種菌的檢測靈敏度達到1～10 pg。陸紅玉等[22]建立了適合食蟹猴志賀氏菌、沙門氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌這三種致病菌快速檢測的多重PCR方法，該方法對137例食蟹猴肛拭子中志賀氏菌屬、沙門氏菌屬和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌3 種病原菌檢測的靈敏度達到100～200 CFU/mL。上述三種多重PCR方法都與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法和單重PCR方法比較，證實該方法能從混合感染的標(biāo)本中，檢測出不同的病原菌，檢測結(jié)果的一致性為96%～100%，且細菌檢出率高于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，說明該方法具有很高的檢測靈敏度和特異性，具有很強的實用性和潛在的發(fā)展力。

邢進[23]等建立了石膏樣毛癬菌(Tm)、石膏樣小孢子菌(Mg)、犬小孢子菌(Mc)和猴類毛癬菌(Am)的多重PCR檢測方法，對260份實驗動物毛發(fā)樣本進行檢測，最低檢測限達到5.9 ～9.5 pg/μL，且檢測結(jié)果均為陰性，未發(fā)現(xiàn)4種真菌的感染，與SDA方法檢測結(jié)果一致，證明在實驗動物中的皮膚真菌感染率始終保持在極低水平；對15份人工感染四種不同真菌的大鼠毛發(fā)檢測，準(zhǔn)確的檢測出不同的菌株組合。證明該法具有良好的可重復(fù)性、靈敏性、特異性，可用于在實驗動物皮膚病原真菌的快速檢測和篩查，具有較高的應(yīng)用價值。

3 多重PCR在病毒性混合感染的病原檢測中的應(yīng)用

目前實驗室病毒檢測方法主要參照國標(biāo)GB 14922.2-2011，采用ELISA血清學(xué)的方法檢測，但這種方法的敏感性和特異性取決于抗原的制備[24]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，病毒大量增殖時動物尚未產(chǎn)生抗體，隨著抗體的產(chǎn)生，病毒逐漸清除[25-26]。通常感染猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV)和猴T細胞趨向病毒1型(STLV-1)的獼猴通常不表現(xiàn)出臨床癥狀，體內(nèi)可能會產(chǎn)生較低水平的抗體，或在感染后很長一段時間，體內(nèi)仍無血清學(xué)轉(zhuǎn)化。因此檢測這兩種病毒不應(yīng)采用血清學(xué)方法。為確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，通常對所有血清學(xué)陰性的動物再次結(jié)合PCR進行檢測。李曉燕等[27]建立了一種能同時檢測獼猴STLV-1和SRV/D-1兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒的多重PCR方法，結(jié)果顯示建立的多重PCR方法能同時檢測出獼猴體內(nèi)可能存在的STLV-1和SRV/D-1 兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒，可用于獼猴種群逆轉(zhuǎn)錄病毒的定性監(jiān)測。

大量文獻對其它實驗動物，如大小鼠[28]、水貂[29]、犬[30]、樹鼩[31]、兔[32]等應(yīng)用建立的多重PCR方法檢測病毒混合感染，結(jié)果表明所建立的多重PCR方法具有快速高效、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，可用于實驗動物的質(zhì)量監(jiān)測。饒丹等[33]建立了鑒別檢測大鼠細小病毒(RPV)與其他三種大鼠細小病毒(H-1、KRV、RMV)的多重PCR方法，多重PCR結(jié)合測序在檢測23份臨床樣本中，PCR的最低檢測限可達1000拷貝每微升，檢測出30.43%的RMV陽性，具有靈敏度高及操作簡單等優(yōu)點，是一種簡便、可靠的檢測方法。以及近來廣東實驗動物監(jiān)測所設(shè)利用多重PCR技術(shù)和Luminex技術(shù)結(jié)合，建立了一種可以同時檢測大鼠5種病原體的方法；應(yīng)用多重PCR熒光技術(shù)實現(xiàn)對小鼠腦脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的檢測等，證實這兩種方法都具有快速高效、特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點。綜上所述，表明多重PCR技術(shù)應(yīng)用于實驗動物病毒檢測有很大的優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿Γ枚嘀豍CR技術(shù)與其它新型技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于實驗動物的檢測，將是未來研究的一個方向。

4 多重PCR技術(shù)在細菌耐藥性方面的研究

動物濫用藥導(dǎo)致的細菌耐藥性已成為全世界關(guān)注的熱點問題，且我國動物源細菌性監(jiān)測工作起步比較晚，動物源細菌耐藥性檢測能力仍嚴重不足[34]。大腸桿菌、沙門氏菌等是動物易感染的細菌，雖然可通過改善養(yǎng)殖條件和加強飼養(yǎng)管理來防治，但目前仍主要通過抗菌劑治療[35]。特別是針對實驗猴這類高等動物，沙門菌病和由志賀菌屬引起的細菌性痢疾是實驗猴常見的腸道病[36]。這兩種病治療均以抗菌為主，常選用氨芐西林、慶大霉素、氧氟沙星等來治療，抗生素雖在短期內(nèi)可緩解腹瀉癥狀，但從整個慢性病程看，并無效[37]。目前，一些動物機構(gòu)的養(yǎng)殖人員對抗生素的使用存在錯誤認識，認為多使用幾種抗生素總會有一種起作用，因此造成療效不確切時易產(chǎn)生交叉感染，使致病菌和條件致病菌耐藥性增強，而在有療效時也無法弄清是哪一種藥物起的作用[38]。并且還存在一些獸醫(yī)在動物輕微感染的情況下就使用抗生素，隨著時間的累積，一旦產(chǎn)生耐藥，將導(dǎo)致患病的實驗動物治療效果不理想。目前細菌耐藥性的監(jiān)測手法主要為藥敏監(jiān)測方法。藥敏試驗由于方便、簡捷、易判定的優(yōu)點，尤其是藥敏紙片瓊脂擴散法，常用于臨床上指導(dǎo)用藥。但藥敏試驗是在體外用藥物試探性的檢驗細菌的表型耐藥特性，不能檢測細菌的隱型耐藥性，且藥敏實驗受不同藥敏試驗方法和判斷藥物敏感濃度差異等影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，目前還存在一些動物機構(gòu)，動物患病直接先上抗生素，再采樣進行培養(yǎng)及鑒定和藥敏檢測，根據(jù)這個流程，真正的致病菌往往已經(jīng)受抗生素影響，等藥敏實驗的結(jié)果出來，往往出現(xiàn)藥敏結(jié)果與臨床療效不符合的情況。而多重PCR具有的快速、敏感、特異等優(yōu)點，可以在同一反應(yīng)體系檢測多種極微量的耐藥基因，能更準(zhǔn)確有效的提供細菌耐藥的信息，且不需要經(jīng)過費時的細菌培養(yǎng)，已廣泛的應(yīng)用于細菌耐藥性的研究。楊鑫等[39]利用多重PCR方法篩選了豬源雞源大腸桿菌氯霉素類藥物耐藥基因(cat1、cmlA、flor)，建立了這3種耐藥基因篩選的三重試劑盒，并利用試劑盒對33株細菌的耐藥性進行檢測，同時將多重PCR檢測結(jié)果和藥敏試驗結(jié)果比較，表明兩者檢出的符合率為91%；共收集來自不同省豬、雞養(yǎng)殖場的417株細菌，進行豬源雞源大腸桿菌氯霉素抗性基因檢測，三種基因的檢出率分別為：41.5%、35.7%和37.2%，不同省的耐藥基因檢出率差異較明顯。目前，我國尚未有對猴場耐藥基因的分布及篩選的相關(guān)報道，大部分都是針對豬、雞養(yǎng)殖場的耐藥基因分布進行統(tǒng)計調(diào)查和篩選。因此，開發(fā)和建立一種能快速篩選病原微生物耐藥基因的方法，特別是針對實驗猴這類國家級保護動物，用于實驗動物耐藥性的研究，提高動物感染病原菌的治療率非常有必要。因此，多重PCR技術(shù)對推進病原物的耐藥性研究將具有十分重要的意義。

5 多重PCR技術(shù)的應(yīng)用情景

多重PCR實驗技術(shù)在實驗動物的微生物、寄生蟲、細菌耐藥性等方面的檢測比單一的普通PCR技術(shù)具有方便、快捷的優(yōu)點，一次可以同時檢測多種基因，即達到了保證實驗動物的質(zhì)量，又節(jié)省了人力與物力。但多重PCR技術(shù)應(yīng)用在實驗動物病原檢測中也存在不足。比如假陽性結(jié)果，研究人員可以通過對實驗室實現(xiàn)嚴格的分區(qū)，加強實驗室的管理，每次實驗設(shè)立嚴格的陰陽性對照等來消除。

多重PCR技術(shù)未來的研究主要集中在以下幾個方面。首先，多重PCR試劑盒在開發(fā)并應(yīng)用于實驗動物的疫病檢測中，當(dāng)前主要用于豬、牛羊、大小鼠的病原微生物診斷，而應(yīng)用于實驗猴，樹鼩的檢測甚少。非人靈長類是人類的近親，在生物學(xué)、遺傳學(xué)和行為學(xué)等方面與人類高度相同，被廣泛的應(yīng)用于多種疾病動物模型的研究[40-41]，是極其珍貴的實驗動物。樹鼩，由于其體型小，孕期短，生長快、容易飼養(yǎng)、在生物進化史上更接近人類等優(yōu)點，作為一種新型的實驗動物資源，正受到廣泛的重視[42-43]。對實驗猴、樹鼩等其它一些新型的實驗動物攜帶的病毒、細菌、寄生蟲指標(biāo)進行控制，開發(fā)和建立快速、可靠的新型監(jiān)測手段非常迫切。因此，研制針對于猴、樹鼩等新型實驗動物疫病的多重PCR標(biāo)準(zhǔn)診斷試劑盒，用于動物疫病的監(jiān)測，將有很大的應(yīng)用前景。其二，多重PCR試劑盒具有的高效快捷、高度特異敏感等優(yōu)點，在面對人獸共患病，公共衛(wèi)生危機方面避免了耗時、大量的費力排查[44-45]。多重PCR試劑盒研發(fā)和生產(chǎn)，使其在公共衛(wèi)生安全診斷中發(fā)揮更大的優(yōu)勢，也是未來的一個發(fā)展方向。最后，多重PCR技術(shù)最大的價值在于它能提高診斷的敏感性。目前，后基因組時代，對基因組候選區(qū)段的重測序需求日益增加，人們對序列的關(guān)注超過了少數(shù)的SNP，候選區(qū)段的范圍可能在5～100 Kb之間，使用傳統(tǒng)sanger法或目標(biāo)區(qū)域雜交捕獲測序價格昂貴，使用多重PCR目標(biāo)區(qū)域捕獲測序很好的解決了這一難題。通過多重PCR對擴增整個基因區(qū)域，一次性捕獲，結(jié)合高通量測序技術(shù)，多樣本同時測序，在大樣本量篩查的同時極大的降低成本。另外，多重PCR技術(shù)與其它技術(shù)的整合應(yīng)用，如多重PCR技術(shù)與LAMP、基因芯片等實驗技術(shù)結(jié)合，進一步提高動物病原檢測的靈敏性、可重復(fù)性，實現(xiàn)大批量實驗動物病原檢測、混合感染樣品基質(zhì)中的多種微生物的有效檢測、實驗動物檢測的標(biāo)準(zhǔn)化，必將在未來實驗動物病原檢測中有很好的應(yīng)用前景。