李 楠，王天奇，何嘉玲，張長勇，暴 國，孫德明

(國家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所， 北京 100081)

隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，實(shí)驗(yàn)動物在多領(lǐng)域多學(xué)科的應(yīng)用日益廣泛，每年有數(shù)千萬的動物用于科學(xué)研究。人類對于實(shí)驗(yàn)動物福利倫理及保護(hù)意識的逐漸增強(qiáng)，安樂死的問題受到了廣泛的關(guān)注。安樂死是實(shí)驗(yàn)動物的關(guān)鍵性福利。然而，如何科學(xué)的選用恰當(dāng)?shù)陌矘匪婪椒饶鼙ＷC動物福利又符合倫理道德標(biāo)準(zhǔn)、方便易行又不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定，是困擾很多科研工作者的一個(gè)難題。本文對國內(nèi)外應(yīng)用安樂死的現(xiàn)狀，實(shí)驗(yàn)動物實(shí)施安樂死的若干問題進(jìn)行闡述，并對國際上常用的幾種安樂死方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行比較及倫理分析。

1 安樂死的實(shí)施背景

1.1 動物實(shí)驗(yàn)的目的

應(yīng)用動物進(jìn)行科學(xué)實(shí)驗(yàn)的目的很多，在有些實(shí)驗(yàn)中，所需要的組織或數(shù)據(jù)不能從活體動物獲取，需對動物執(zhí)行安樂死，才可進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。如癌癥研究需要對動物進(jìn)行剖檢，觀察腫瘤是否轉(zhuǎn)移；神經(jīng)學(xué)研究項(xiàng)目是以在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)注射神經(jīng)解剖示蹤劑或進(jìn)行組織病理學(xué)檢測，進(jìn)而對病灶部位進(jìn)行研究。在這些實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)動物提供體外研究的細(xì)胞或組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物痛苦程度超過預(yù)期

在動物實(shí)驗(yàn)中，不可避免的會對動物造成痛苦或傷害，有些傷害是可控的，但有些傷害是不可預(yù)期的，會對動物造成巨大痛苦。如動物持續(xù)處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，其生理、病理均會發(fā)生較大的變化，此時(shí)獲得的動物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是不科學(xué)的、不準(zhǔn)確的。因此，依據(jù)動物福利和動物保護(hù)的原則，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)采取恰當(dāng)?shù)姆椒▽游镞M(jìn)行安樂死，確保動物的痛苦降到最低。

1.3 動物實(shí)驗(yàn)失敗或無法完成

動物實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常出現(xiàn)意外的情況。當(dāng)發(fā)現(xiàn)動物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)失敗，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)無法得到有意義的結(jié)果時(shí)，應(yīng)實(shí)施仁慈終點(diǎn)：立即停止動物實(shí)驗(yàn)。為盡早終止受試動物的實(shí)驗(yàn)痛苦，應(yīng)實(shí)施安樂死。

1.4 其他不適合繼續(xù)繁殖或飼養(yǎng)的原因

安樂死是實(shí)驗(yàn)中不需要的健康動物的默認(rèn)選擇。如果動物因性別、年齡或基因型、或在某些科學(xué)研究中動物已經(jīng)進(jìn)行了一些實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)致其無法用于其他實(shí)驗(yàn)時(shí)，研究人員會從實(shí)驗(yàn)中去除這些動物。但安樂死剝奪了健康動物的未來，目前國外正在嘗試尋找可靠的家庭來收養(yǎng)健康但不被需要的實(shí)驗(yàn)室動物，使得這些動物除了安樂死外，還有其他的命運(yùn)可以選擇。對于目前使用數(shù)以萬計(jì)的大小鼠和魚來說，采用此辦法是個(gè)不錯(cuò)的選擇，但是轉(zhuǎn)基因動物由于其特殊性，不能采用此種方法[1-2]。

2 安樂死的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)

當(dāng)實(shí)驗(yàn)動物的身體出現(xiàn)以下狀況，應(yīng)立即執(zhí)行安樂死：①體重減輕：當(dāng)實(shí)驗(yàn)動物體重減輕達(dá)原體重的20%～25%，或動物出現(xiàn)惡病質(zhì)或消耗性病癥。②食欲喪失：小型嚙齒類動物完全喪失食欲達(dá)到24小時(shí)或食欲不佳(低于正常食量50%達(dá)到3天。大動物完全喪失食欲達(dá)5天或食欲不佳(低于正常量之50%)達(dá)7天。③虛弱或?yàn)l死：無法進(jìn)食或飲水，動物在沒有麻醉或鎮(zhèn)靜的狀態(tài)下，長達(dá)24 h無法站立或極度勉強(qiáng)才可站立，或表現(xiàn)精神抑郁伴隨體溫過低(常溫動物低于37℃)。④嚴(yán)重感染：體溫升高白細(xì)胞數(shù)目增加，且抗生素已經(jīng)無效并伴隨動物全身性的不適癥狀。⑤腫瘤：自發(fā)性或?qū)嶒?yàn)性腫瘤，均需仁慈終點(diǎn)評估。腫瘤生長超過動物原體重的10%，腫瘤平均直徑在成年小鼠超過20 mm、成年大鼠超過40 mm；體表腫瘤表面出現(xiàn)潰瘍、壞死或感染；腹腔異常擴(kuò)張、呼吸困難；出現(xiàn)神經(jīng)精神癥狀。⑥動物預(yù)后不佳：出現(xiàn)器官嚴(yán)重喪失功能的臨床癥狀且治療無效，或經(jīng)實(shí)驗(yàn)動物醫(yī)師判斷預(yù)后不佳：如呼吸困難、發(fā)紺、內(nèi)臟摘除手術(shù)；腎衰竭、中樞神經(jīng)抑制、肢體功能喪失、皮膚傷口無法愈合、重復(fù)性自殘或嚴(yán)重燙傷等[1]。

世界各地研究機(jī)構(gòu)可接受的小鼠腫瘤大小的標(biāo)準(zhǔn)也不同，爭議較大。Nature規(guī)定癌癥研究論文，腫瘤大小不應(yīng)超過15 mm；麻省總醫(yī)院IACUC動物福利指南中的限制規(guī)定也是15 mm。但這些并不具有廣泛的代表性；2010年一個(gè)癌癥研究小組發(fā)布的指南推薦的直徑不應(yīng)該超過12 mm。美國機(jī)構(gòu)指南通常推薦最大為20 mm，具有廣泛的代表性。按照中國動物福利的倫理審查國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的審查原則，即必要性原則來分析，當(dāng)模型小鼠腫瘤超過20 mm，腫瘤疫病模型已經(jīng)完全形成，已不再具有可逆性，因此，沒有必要繼續(xù)生長，使動物遭受更大的和不必要傷害。

安樂死的倫理判定，應(yīng)遵循國家標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)安樂死的原則性要求[3]。并應(yīng)該讓熟悉動物的獸醫(yī)、實(shí)驗(yàn)人員和倫理審查人員從專業(yè)的角度來共同決定安樂死執(zhí)行的最佳時(shí)機(jī)，最大程度的減少動物痛苦。

3 安樂死前的動物福利

在動物執(zhí)行安樂死前，必須確保實(shí)驗(yàn)動物享有其本應(yīng)享有的福利待遇。一旦動物被確定執(zhí)行安樂死，研究人員必須準(zhǔn)備迅速的采取行動，因其他事由導(dǎo)致的延遲會增加實(shí)驗(yàn)動物的痛苦。在安樂死執(zhí)行之前，房間里的動物越多，它們相處的時(shí)間越長，群體間壓力和潛在侵略性就越大。動物生命的最后時(shí)刻，不應(yīng)使其再經(jīng)歷生疏環(huán)境與其他動物和人類操作的驚擾和產(chǎn)生的緊張及驚嚇[34]。在安樂死實(shí)施過程中，應(yīng)予以溫和的處理方法，遵循恰當(dāng)使用鎮(zhèn)定劑或麻醉劑的原則。

4 現(xiàn)行安樂死方法比較及倫理分析

如何判斷一種安樂死方法是否人道？這是一個(gè)獨(dú)一無二的難題，由于動物無法說出它們的感受，人類很難解讀動物行為。但人類在了解動物福利的影響方面取得了重大進(jìn)展。

目前采用安樂死的方法主要分為三種，非吸入性麻醉法、吸入法和物理法。非吸入性麻醉法即為過量用藥，如應(yīng)用巴比妥類藥物過量麻醉；吸入法為應(yīng)用二氧化碳、一氧化碳或氮?dú)獾葰怏w替換氧氣，或用吸入性麻醉藥，如異氟醚、乙醚等；物理方法包括頸椎脫位、斷頭術(shù)、窒息、冰凍、微波輻照等，

4.1 非吸入性麻醉劑

通過注射過量的藥物，使動物迅速死亡，是非?？煽康膭游锇矘匪婪椒?。注射性麻醉劑有多種給藥方式，靜脈注射是最佳選擇。目前在藥物選擇中，應(yīng)用過量的巴比妥類及其衍生物的藥物是對動物執(zhí)行安樂死的優(yōu)選方法，適宜的動物種類包括嚙齒類動物、兔、犬、貓、非人靈長類動物、豬、牛、馬、兩棲動物、爬行動物、家禽，應(yīng)用范圍較廣，巴比妥類藥物會導(dǎo)致意識快速喪失繼而呼吸停止，但有些個(gè)體注射時(shí)會誘發(fā)持續(xù)的興奮期繼而喪失意識。由于小動物(如大鼠、小鼠等)靜脈注射比較困難，通常會采用腹腔注射巴比妥。但腹腔注射巴比妥會因其堿性而導(dǎo)致動物腹部扭曲造成疼痛，因此在會在麻醉劑中加入局麻藥(利多卡因)顯著緩解因巴比妥注射而引發(fā)的傷害[1]。對于大動物，較為公認(rèn)的最好的方法是：首先給予安定劑，待動物進(jìn)入安靜狀態(tài)時(shí)，再行靜脈注射過量的巴比妥酸鹽，該法可最大限度地減少動物的緊張和掙扎。

注射巴比妥藥物的優(yōu)點(diǎn)在于可以平穩(wěn)的誘導(dǎo)并麻醉動物，因?yàn)槠湫Ч绖┝?、濃度和投藥方式而不同，可使動物的不適反應(yīng)降到最低，失敗的可能性低于物理方法，可以保留完整的身體結(jié)構(gòu)。

注射巴比妥類藥物的缺點(diǎn)在于要提高對于獲取、存儲、使用及記錄相關(guān)藥品的要求，與物理方法相比較慢，一次僅能殺死一只動物；藥物會對組織造成污染；如果安樂死的動物被其他動物所吃掉，有藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn)，并會對某些研究項(xiàng)目中的肝臟或其他生理功能產(chǎn)生影響。目前美國允許將氯胺酮及三溴乙醇單獨(dú)或共同用藥執(zhí)行動物安樂死，但阿片類藥物作用比較緩慢，不是真正的麻醉藥。因此，不推薦過量應(yīng)用阿片類藥物作為安樂死的方法。

使用巴比妥類會引起一些動物福利問題，包括抓取動物進(jìn)行注射而導(dǎo)致的應(yīng)激；在血管周圍注射溶液后潛在的疼痛；劑量沒有掌控好，沒有進(jìn)行死亡的驗(yàn)證，有潛在復(fù)蘇的可能。這種安樂死方法需要采用輔助的方法確認(rèn)動物是否死亡；需要對人員開展準(zhǔn)確實(shí)施腹腔注射或靜脈注射的相關(guān)培訓(xùn)。

4.2 吸入性麻醉劑

4.2.1 二氧化碳法

動物暴露于二氧化碳中，二氧化碳會從環(huán)境中進(jìn)入肺泡，然后是血液，當(dāng)大腦中二氧化碳含量到達(dá)一定濃度，會導(dǎo)致意識喪失繼而死亡。這是處死實(shí)驗(yàn)嚙齒動物最廣泛使用的方法。出生一天雛雞使用二氧化碳的安樂死效果良好，在農(nóng)業(yè)上，也廣泛用于處死家禽和豬。該方法簡單、安全、有效、廉價(jià)、不污染組織。但由于二氧化碳與水發(fā)生反應(yīng)，在濕潤組織中生成酸，酸會產(chǎn)生刺痛的感覺，使動物在喪失意志前感受到痛苦。二氧化碳的濃度越高，動物失去意識的時(shí)間就越短，反之，當(dāng)二氧化碳濃度增長緩慢時(shí)，也會延長動物失去意識的時(shí)間。

目前沒有科學(xué)研究表明動物短暫的明顯疼痛與長時(shí)間慢性疼痛相比是更好還是更差。有研究表明二氧化碳濃度超過50%會引發(fā)人類的疼痛，在嚙齒類動物的鼻、眼的上皮細(xì)胞中，存在相似密度的類似傷害感受器，傷害感受器會對類似濃度的二氧化碳作出厭惡反應(yīng)。有科學(xué)家研究表明安樂死前預(yù)先填充10%～30%的二氧化碳效果較好。在加拿大管理動物安樂死中，建議每分鐘填充20%～30%的二氧化碳。在緩慢充氣過程中，二氧化碳達(dá)到可能引發(fā)疼痛的濃度前，動物已經(jīng)被麻醉了。在預(yù)充或快充過程中，動物在暴露于50%濃度之前，已經(jīng)喪失意識了[5-6]。

應(yīng)用二氧化碳是一種安全的、低成本的技術(shù)，要求不高，可同時(shí)殺死多只動物。在通風(fēng)良好的場所配合適當(dāng)?shù)脑O(shè)備使用時(shí)，比其他藥劑安全；操作者能以最低的風(fēng)險(xiǎn)對動物進(jìn)行安樂死，不破壞身體結(jié)構(gòu)(且二氧化碳不會污染任何組織)。

二氧化碳吸入法的缺點(diǎn)在于由于二氧化碳比空氣重，在容器內(nèi)尚未灌滿時(shí)，動物往往將頭部抬高而難以迅速死亡；有些動物對二氧化碳的耐受性較高，如牛、馬等大型動物、魚類、水中哺乳類、新生嚙齒類動物，往往無法有效的吸入足量的二氧化碳，需要較長時(shí)間操作才能完成安樂死。

使用二氧化碳會引起一些動物福利問題，很多研究都發(fā)現(xiàn)動物對較低濃度二氧化碳厭惡。有證據(jù)表明20%二氧化碳即可激活大鼠的恐慌[7]。在執(zhí)行二氧化碳的安樂死過程中，目前還沒有辦法可以讓動物免于痛苦(除非動物用非抑制性麻醉劑預(yù)先麻醉)。為保證動物減少痛苦，可以采取漸近式充氣(每分鐘小于40%)避免引發(fā)疼痛。如果在動物飼養(yǎng)籠中處死動物，應(yīng)盡可能避免抓取應(yīng)激，在動物放松(甚至睡著)狀態(tài)下飼養(yǎng)籠內(nèi)實(shí)施處死操作，從而減少“過程性應(yīng)激”。同時(shí)應(yīng)結(jié)合其他物理方法，如放血、斷頭等確認(rèn)動物死亡。

4.2.2 其他吸入性麻醉劑

鹵代類吸入麻醉劑如異氟醚、七氟醚、氟烷等，可以用作實(shí)驗(yàn)室的嚙齒類動物的麻醉劑，應(yīng)用過量的吸入性麻醉劑執(zhí)行安樂死也是一種較好的選擇，可以作為二氧化碳的替代方案。缺點(diǎn)是當(dāng)動物暴露于致死劑量的麻醉劑時(shí)，許多物種的動物均顯示出相同的厭惡和應(yīng)激行為，與暴露于二氧化碳的動物表現(xiàn)一樣。此外，當(dāng)動物進(jìn)入吸入性麻醉劑容器中，由于麻醉劑量被容器設(shè)置成亞致死濃度，因此，安樂死的過程非常緩慢；在執(zhí)行安樂死的過程中，為增加容器內(nèi)麻醉劑的濃度，會在容器內(nèi)放入被麻醉劑浸泡過的紗布，刺激性的液體可能會直接接觸動物。有些動物對高濃度的鹵代類吸入麻醉劑有一些厭惡，但是不會像應(yīng)用高濃度二氧化碳那樣誘發(fā)疼痛[8]。但在大多數(shù)情況下，并沒有找到這些替代物可以替換二氧化碳的優(yōu)勢。除去對動物福利的關(guān)注，揮發(fā)性麻醉劑是環(huán)境污染物，與二氧化碳相比毒性更大。

目前有研究利用氮?dú)夂蜌鍤鈦硖鎿Q氧氣.盡管對嚙齒類動物來說，缺氧是痛苦的，但當(dāng)豬暴露于氦氣時(shí)，其痛苦較小。跨物種的安樂死方法需要謹(jǐn)慎，在氮誘導(dǎo)缺氧的安樂死方法中得到了較好的驗(yàn)證。雖然大多數(shù)哺乳動物對氮誘導(dǎo)缺氧厭惡，但是，在家禽類應(yīng)用效果較好，實(shí)驗(yàn)證明，嚙齒類動物和水貂是不可應(yīng)用氮?dú)膺M(jìn)行安樂死，但是在豬和家禽類是可以接受的[3]。

應(yīng)用一氧化氮安樂死會誘發(fā)動物失去意識。一氧化氮不僅會使動物遭受痛苦，也會對人的安全造成威脅，因此不推薦使用。乙醚對黏膜具有刺激性，易燃。乙醚一般用于實(shí)驗(yàn)室安樂死，如肝細(xì)胞的收集測定等。

4.3 物理方法

物理的安樂死方法主要有頸椎脫位、撞擊頭部、斷頭、放血、微波刺激等；物理法只要在良好的技巧及適當(dāng)?shù)墓ぞ叩呐浜舷拢苎杆偈箘游锝獬弁此劳觥５俏词苓^訓(xùn)練的人去實(shí)施物理性方法，不僅容易造成人員受傷，更可能使動物因未完全死亡而造成極大的痛苦。有些方法，如放血、腦脊髓穿刺等，不建議作為動物安樂死的單一方法，配合其他方法使用較好。

對于一些小動物(如嚙齒動物、禽類、仔兔、鳥類)斷頭和頸椎脫位被認(rèn)定為是可接受的方法，但其關(guān)鍵在于操作者的技能。為保證動物福利，物理性安樂死方法的最佳做法是對操作人員進(jìn)行系統(tǒng)的培訓(xùn)。相對而言，斷頭不是理想的方法，但由于爬行動物和兩棲動物的中樞系統(tǒng)對腦缺氧相對不敏感，因此斷頭是它們執(zhí)行安樂死的唯一選擇，如對此類動物進(jìn)行安樂，應(yīng)先進(jìn)行鎮(zhèn)靜，目的是迅速抑制維持意識的腦中樞[9-10]，減少動物痛苦。

目前，國際上可以接受的專業(yè)物理方法通常使用專門微波設(shè)備及低溫設(shè)備。對于斑馬魚，應(yīng)將其快速浸入冰水中造成低體溫，迅速引發(fā)冷休克[11-12]；對于新生嚙齒動物，推薦緩慢冷卻，無需直接將它們放在預(yù)冷的表面，放在預(yù)冷的表面會在低體溫誘發(fā)無意識之前引發(fā)疼痛。

物理方法的優(yōu)點(diǎn)在于這種方法通常很便宜，無化學(xué)藥劑污染組織，執(zhí)行完成度高，且僅需要很少的設(shè)備或不需要設(shè)備，快速；缺點(diǎn)在于：對操作者的技術(shù)要求較高，如操作技術(shù)不佳，恐無法使動物迅速死亡，而導(dǎo)致動物的更大痛苦；不適用于保持動物頭/頸部完整的研究；一次只能殺死一只動物；在抓取和保定的時(shí)候可能導(dǎo)致動物緊張。

從動物福利角度來說，在物種合理的情況下，物理方法是最合適的安樂死方法，可以避免或減小動物死亡前所承受的不必要的疼痛和痛苦，但是對實(shí)施安樂死的人員感官刺激較大，需要加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)者的心理培訓(xùn)[13]；并且所有的物理方法均會產(chǎn)生創(chuàng)傷，對動物和人都存在潛在的危險(xiǎn)，因此，對于操作數(shù)熟練程度是至關(guān)重要的。

5 小結(jié)

選擇不恰當(dāng)?shù)陌矘匪婪椒〞箘游镌馐芫薮笸纯啵虼?，在每?xiàng)研究中要始終考慮最佳的安樂死方法，考慮要素包括：動物的福利性、科學(xué)性、實(shí)踐性和動物種類等，并不是所有方法都適用于所有動物和每一次特定的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，選擇恰當(dāng)?shù)陌矘匪婪椒ㄊ侵陵P(guān)重要。