， ， ，，， ，，， ，，

目前已存在幾種核酸擴(kuò)增方法[1-4]，而PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是目前使用最廣泛的技術(shù)，該基因擴(kuò)增方法已被應(yīng)用于臨床，特別是在分子檢測(cè)方面，在傳染病診斷中尤其如此，例如肝炎和結(jié)核等，以及一些遺傳疾病?；驒z測(cè)步驟包括從標(biāo)本中提取核酸，進(jìn)行基因擴(kuò)增和檢測(cè)，這些步驟需要一定的操作技術(shù)和昂貴的儀器設(shè)施，在資金投入緊張的國(guó)家和地區(qū)，使用受到限制，且PCR的循環(huán)過程變溫會(huì)消耗一定時(shí)間。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等[5]人研究的一種分子擴(kuò)增技術(shù)，可以快速大量的擴(kuò)增目的片段，等溫?cái)U(kuò)增解決了變溫的時(shí)間損耗，現(xiàn)被應(yīng)用于臨床檢測(cè)中，并被不斷完善，在臨床檢測(cè)中具有非常重要的意義。

1 LAMP原理

LAMP技術(shù)的核心之一在于引物的設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)出特異性強(qiáng)的引物是LAMP的第一步也是開始的關(guān)鍵。LAMP引物是針對(duì)DNA的靶序列設(shè)計(jì)一對(duì)外引物F3與B3，以及一對(duì)內(nèi)引物FIP和BIP，內(nèi)引物FIP是由F2和FIc組成，BIP是由B2和B1c組成[6]。反應(yīng)的進(jìn)行依托于DNA置換酶的活性和引物的特異性。在初始過程中，4個(gè)引物都參與反應(yīng)，但是在循環(huán)反應(yīng)中只有內(nèi)引物參與DNA序列的置換合成。內(nèi)引物分為上內(nèi)引物(FIP)和下內(nèi)引物(BIP)，每一個(gè)內(nèi)引物含有2個(gè)不同的序列，與靶序列的正向序列和反向序列相對(duì)應(yīng)，一個(gè)用于第一步的啟動(dòng)，另一個(gè)以自身為模版進(jìn)行第二階段的循環(huán)擴(kuò)增，即目的片段的尾端內(nèi)側(cè)序列被命名為F2c和B2。F2c和B2尾端內(nèi)側(cè)的2個(gè)序列被稱為F1c和B1，外側(cè)的2個(gè)序列稱為F3c和F3。鑒于這種結(jié)構(gòu)，F(xiàn)IP和BIP被命名為內(nèi)引物。FIP包含F(xiàn)1c，1個(gè)TTTT片段以及互補(bǔ)于F2c的序列F2。BIP包含的是與B1互補(bǔ)的序列B1c，TTTT片段和B2。2個(gè)外引物包括的是B3和F3c互補(bǔ)的序列F3。1個(gè)含有靶序列和4個(gè)引物的DNA樣品加熱變性后在冰上快速冷卻。之后，加入Bst DNA大片段置換酶，65 ℃ 1 h，開始LAMP反應(yīng)[5]。

2 反應(yīng)特點(diǎn)

LAMP反應(yīng)的幾個(gè)方面與其他擴(kuò)增方法不同。LAMP方法的主要特征是只需要一種酶，使其在65 ℃范圍內(nèi)的等溫條件下擴(kuò)增核酸。因此，它允許使用簡(jiǎn)單且具有低成本效益的反應(yīng)設(shè)備，在臨床檢測(cè)中可以更好的實(shí)施。

LAMP方法具有高特異性和高擴(kuò)增效率。由于LAMP方法使用4種識(shí)別模板DNA上6個(gè)不同區(qū)域的引物，其特異性極高。例如，LAMP方法可以特異性擴(kuò)增來自區(qū)分單個(gè)核苷酸差異的人類基因組標(biāo)本中的特定基因[7]。

LAMP方法的分離效率非常高，等溫也不需要變溫過程的時(shí)間浪費(fèi)。 LAMP方法在30～60 min內(nèi)對(duì)25 μL反應(yīng)混合物合成10～20 μg特異性DNA[8]。尤其加入特異性環(huán)引物可以有助于將擴(kuò)增時(shí)間縮短到原始LAMP方法的1/2或1/3[9]。

該方法還可用于擴(kuò)增靶RNA序列。Notomi等人開發(fā)了一步，單管，實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄循環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)測(cè)定法，用于檢測(cè)甲型肝炎病毒(HAV)基因組中非翻譯區(qū)的序列[10]。在這種情況下，與DNA的擴(kuò)增相同的一步擴(kuò)增可以通過同時(shí)添加逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行，因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄酶也顯示出鏈轉(zhuǎn)移活性。

3 LAMP研究進(jìn)展

自從2000年[5]第一次報(bào)道了LAMP，LAMP就成為了分子擴(kuò)增領(lǐng)域廣泛研究的重點(diǎn)，在不斷的研究中LAMP技術(shù)越來越完善。2002年Nagamine等人[9]設(shè)計(jì)應(yīng)用環(huán)引物，大大縮短了LAMP反應(yīng)時(shí)間；同年Nagmine等人[11]使用TspRI酶實(shí)現(xiàn)了DNA的單鏈分離擴(kuò)增；2005年Enomoto等人[12]通過將LAMP與逆轉(zhuǎn)錄相結(jié)合，建立了RT-LAMP技術(shù)；2006年Yoneyama等人[10]開發(fā)了單管一步逆轉(zhuǎn)錄法，對(duì)肝炎病毒進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄；同年Hirayama等[13]應(yīng)用LAMP方法對(duì)水牛胚胎進(jìn)行了性別鑒定并克隆了性染色體的特異性序列，對(duì)于物種的繁殖作出了非常重要的貢獻(xiàn)。此外，2006年P(guān)oon等人[14]未提取DNA直接進(jìn)行LAMP，成功檢測(cè)到惡性瘧原蟲陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)之后的檢測(cè)技術(shù)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。Kaneko等人[15]在2007年通過檢測(cè)LAMP對(duì)生物的耐受性，進(jìn)行了未提取DNA的病毒LAMP實(shí)驗(yàn)，再一次表明LAMP可以不經(jīng)過DNA提取而進(jìn)行擴(kuò)增，只是結(jié)果沒有經(jīng)過提取的效果好。

3.1可視化發(fā)展 2001年Mori等人發(fā)現(xiàn)了根據(jù)濁度對(duì)反應(yīng)進(jìn)行肉眼的直觀判斷[8]，但是因根據(jù)肉眼分辨濁度具有強(qiáng)烈的主觀性，Le等人[16]發(fā)現(xiàn)，在陽(yáng)光照射下，用肉眼確定管之間的靈敏度和變異性是困難的，且陽(yáng)性樣品的濁度只在短時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定。意味著必須在反應(yīng)之后盡快進(jìn)行監(jiān)測(cè)[17]，更需要濁度計(jì)進(jìn)行準(zhǔn)確客觀的判斷，然而使用濁度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，不夠經(jīng)濟(jì)實(shí)用，因而，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)結(jié)果的可視化，成為了學(xué)者們關(guān)注的焦點(diǎn)。

DNA具有能和染料結(jié)合的特異性分子結(jié)構(gòu)dsDNA，通常，染料與dsDNA的復(fù)合物的形成會(huì)使染料發(fā)生可見的顏色變化，因此此類染料可用于LAMP產(chǎn)物的可視化。2003年，Iwamoto等人[18]首次使用SYBR-Green I用于LAMP結(jié)果鑒定，研究發(fā)現(xiàn)[19]DNA結(jié)合染料的檢測(cè)靈敏度都遠(yuǎn)高于濁度檢測(cè)的靈敏度。目前，許多熒光染料已被用于定性檢測(cè)。在存在足夠的dsDNA的情況下，熒光染料SYBR-Green I的顏色從橙色變?yōu)榫G色，且在自然光下，顏色變化依然易于分辨[19-20]。另一方面，通過添加DNA結(jié)合染料提高靈敏度與較高的運(yùn)行成本有關(guān)。另外，由于需要打開反應(yīng)管以增加染料，因此增加了污染風(fēng)險(xiǎn)。為了克服后者的缺點(diǎn)，2012年，Hong等人[21]研究出了兩步法，以避免打開管：SYBR-Green I染料懸浮在管內(nèi)的錫箔上，在LAMP反應(yīng)后，將管離心，使染料落入LAMP反應(yīng)混合物中。使用該方法，當(dāng)最小模板濃度為1拷貝/μL時(shí)，可以檢測(cè)到LAMP的產(chǎn)物。同樣，Quant-iT PicoGreen[22]，GeneFinder[17,23-24]，和溴化乙錠[22]也被用于LAMP結(jié)果的檢測(cè)。2006年，Yasuyoshi等人[25]把聚乙烯亞胺用于LAMP的結(jié)果檢測(cè)，用來增強(qiáng)染料標(biāo)記。在使用聚乙烯亞胺增強(qiáng)的方法中，使用熒光標(biāo)記的DNA探針結(jié)合LAMP產(chǎn)物，隨后加入聚乙烯亞胺中和染料標(biāo)記的LAMP產(chǎn)物，產(chǎn)生具有清晰的顏色的沉淀物，可以通過肉眼直接對(duì)結(jié)果判定。

然而，DNA結(jié)合染料的方法存在一定的缺陷，主要為會(huì)對(duì)LAMP的擴(kuò)增過程產(chǎn)生抑制[25]，這意味著染料試劑必須在終點(diǎn)加入，避免影響LAMP反應(yīng)。此外，這些染料中的一些，例如溴化乙錠[7]可能是誘變劑，致癌物質(zhì)或致畸物，雖然這取決于接觸程度。

此外，這種方法需要在擴(kuò)增后打開反應(yīng)管，可能會(huì)造成污染。對(duì)此，Liang等人[26]在2013年用微晶蠟將SYBR-Green I染料提前密封在反應(yīng)管中，在LAMP反應(yīng)結(jié)束后通過加熱使蠟融化釋放染料進(jìn)行顯色，這種方法即應(yīng)用了熒光染料的靈敏度又解決了因開蓋而可能產(chǎn)生的污染問題。在2014年Jiang等人[27]成功的應(yīng)用這種方法對(duì)惡性瘧原蟲進(jìn)行了檢測(cè)。

另一種使用間接顯色指示劑的肉眼觀測(cè)方法，指示劑可以加入到LAMP反應(yīng)體系中，進(jìn)行密封一步測(cè)定。因此，與兩步的DNA結(jié)合染料方法相比，降低了產(chǎn)生污染的風(fēng)險(xiǎn)[28]，比如，鈣綠黃素。在2008年鈣綠黃素被Tomita等人[7]首次應(yīng)用在LAMP反應(yīng)結(jié)果檢測(cè)。在擴(kuò)增反應(yīng)前，鈣黃綠素分子與錳離子結(jié)合，LAMP反應(yīng)溶液為橙色，LAMP反應(yīng)過程中生成大量的焦磷酸根，使得鈣綠黃素分子不再結(jié)合錳離子，而與生成的焦磷酸根離子結(jié)合，生成綠色熒光，而且，鈣綠黃素分子與鎂離子結(jié)合，可以增強(qiáng)綠色熒光信號(hào)[7]。然而，在2010年Wastiliing等人[22]發(fā)現(xiàn)，與沒有添加指示劑的反應(yīng)相比，加入鈣綠黃素的似乎降低了LAMP的敏感性。實(shí)際上，鈣綠黃素的存在在一定程度上抑制了LAMP反應(yīng)[22,29]，另一個(gè)原因是鈣綠黃素和雙鏈DNA之間的相互作用導(dǎo)致了反應(yīng)靈敏度的降低[30-31]。

因此，具有相似作用方式的另一種染料HNB進(jìn)入了人們的視線，這種染料是在鎂離子存在下形成紫色，在擴(kuò)增反應(yīng)過程中，伴隨大量的焦磷酸鎂的生成導(dǎo)致反應(yīng)中的鎂離子濃度下降，從而使得含有HNB的反應(yīng)溶液從紫色變?yōu)樗{(lán)色[29]。Wastliing等人[22]研究表示，該試劑不會(huì)對(duì)LAMP反應(yīng)產(chǎn)生抑制，比鈣綠黃素更加適合作為指示劑，因而被廣泛使用[17,21,29,32-34]。

3.2電化學(xué)檢測(cè)法 由于電化學(xué)方法更快，成本更低，更簡(jiǎn)單，并且比光學(xué)的方法更容易以小型化的形式應(yīng)用[35]，這些特點(diǎn)使得電化學(xué)可以作為分析DNA擴(kuò)增結(jié)果的可靠且穩(wěn)定的檢測(cè)方法[36]。因此，現(xiàn)在一部分的焦點(diǎn)為利用電化學(xué)傳感器/芯片和生物傳感器等方法對(duì)LAMP反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。

3.2.1Endpoint 電化學(xué)的活性物質(zhì)與dsDNA的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)電流的變化。比如，在溶液中的Hoechst 33258氧化還原分子可使得DNA在槽中聚集，導(dǎo)致電流反應(yīng)明顯下降。Ahmed[37]和Safavieh[38]等人將分子用作電活性指示劑來檢測(cè)LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，并用探針非固定化方法測(cè)得8.6 fg /μLDNA(24 CFU / mL)[38]，為減少交叉感染的分析，他們開發(fā)了一個(gè)平臺(tái)，允許在單個(gè)設(shè)備中進(jìn)行放大檢測(cè)。使用該裝置和Hoechst 33258指示器，一次可測(cè)得300拷貝量[39]。

3.2.2Real time LAMP反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)可以通過原位電化學(xué)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，依賴于兩種機(jī)制：亞甲藍(lán)(MB)分子與工作電極之間的氧化還原電子轉(zhuǎn)移以及MB與dsDNA的嵌入[40-41]，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，MB與LAMP擴(kuò)增子的嵌入降低了游離MB濃度，從而降低了這種氧化還原電流[42-44]。使用MB作為指標(biāo)，Hsieh[42]和Xie[44]等人得到的檢測(cè)限度分別為16拷貝(4fg /μL)和0.3 pM。然而，MB的DNA結(jié)合親和力為104～105M-1[45]，其與MBL與擴(kuò)增子LAMP在溶液中的低效率相互作用[46]，表明可以通過其他指標(biāo)來實(shí)現(xiàn)較低的檢測(cè)限度。釕六胺缺乏插層配體并與陰離子dsDNA骨架靜電結(jié)合[47]。Ahmed等[46]人將其作為定量監(jiān)測(cè)LAMP擴(kuò)增子的指標(biāo)，在30 min內(nèi)檢測(cè)限為20拷貝/μL。使用單個(gè)生物芯片在單個(gè)聚丙烯管中進(jìn)行體外擴(kuò)增和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，這種方法可以避免在整個(gè)過程中潛在的交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。在理想情況下，電活性指示劑應(yīng)具有化學(xué)穩(wěn)定性，應(yīng)優(yōu)先與dsDNA擴(kuò)增子結(jié)合，不應(yīng)在監(jiān)測(cè)過程中抑制擴(kuò)增[46]。然而，幾乎所有的氧化還原探針都對(duì)DNA的擴(kuò)增存在抑制作用[38]。例如，Hoechst 33258對(duì)聚合酶活性有明顯的抑制作用，并且限制溶液中DNA的擴(kuò)增和感測(cè)。為了克服這個(gè)問題，Zhang等人[24]開發(fā)了一種伏安模式，用于通過測(cè)試游離的2-脫氧鳥苷5-三磷酸(dGTP)的氧化反應(yīng)來監(jiān)測(cè)DNA擴(kuò)增的生物化學(xué)過程，這也是LAMP反應(yīng)中的反應(yīng)物之一。有了這個(gè)方法，抑制問題不再是焦點(diǎn)，因?yàn)闆]有輔助指標(biāo)可以使用。不幸的是，需要將電極置于反應(yīng)中可能會(huì)發(fā)生交叉污染。

3.3生物化學(xué)傳感器 電化學(xué)生物傳感器與某種生物識(shí)別模式聯(lián)合，應(yīng)用于檢測(cè)方法中。已經(jīng)報(bào)道了幾種用于監(jiān)測(cè)LAMP反應(yīng)的電化學(xué)生物傳感器/基于生物芯片的方法。Sun等人[48]通過將序列特異性ssDNA探針固定在離子液體改良的基底電極上來制造電化學(xué)DNA生物傳感器。 然后，他們使用生物傳感器和亞甲基藍(lán)電化學(xué)指示劑來監(jiān)測(cè)雜交的LAMP擴(kuò)增子。Nakamura等[49]人開發(fā)了一種電化學(xué)DNA生物芯片，用Hoechst 33258作為雜交指示劑同時(shí)監(jiān)測(cè)六種LAMP產(chǎn)物。Nakamura等人[50]又通過組合LAMP和基于雜交的電化學(xué)DNA生物芯片成功獲得了特定基因的拷貝數(shù)，其由Genelyze系統(tǒng)，DNA擴(kuò)增1 h和DNA檢測(cè)0.5 h組成。通常，生物傳感器/生物芯片的方法用于直接檢測(cè)特異性序列的目標(biāo)基因片段，以及在LAMP反應(yīng)后進(jìn)行定性檢測(cè)使用。雖然直接檢測(cè)特異性高于間接測(cè)量的特異性，但是制備DNA生物傳感器/芯片是昂貴且耗時(shí)的，特別是在LAMP反應(yīng)時(shí)對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，并不容易實(shí)現(xiàn)。

目前，通過簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)有效的伏安模式監(jiān)測(cè)LAMP反應(yīng)已經(jīng)有了一些進(jìn)展，但是還沒有詳細(xì)的解釋能說明LAMP反應(yīng)物會(huì)污染電極設(shè)備。Ahmed等人[46]觀察到即使在重復(fù)測(cè)量之后，電極面和相對(duì)面上也沒有形成薄膜或污漬。

4 LAMP的未來

目前還沒有足夠穩(wěn)定、簡(jiǎn)單以及經(jīng)濟(jì)的NAT系統(tǒng)供發(fā)展中國(guó)家使用。綜上所述，LAMP及其周邊技術(shù)還在開發(fā)中，用于在發(fā)展中國(guó)家建立最簡(jiǎn)單的用于診斷的NAT系統(tǒng)。這種診斷方法可能對(duì)許多疾病流行的國(guó)家有很大幫助。檢測(cè)LAMP反應(yīng)的理想方法應(yīng)具有高度的敏感性和快速反應(yīng)性，應(yīng)具有低成本和非高密度性，應(yīng)易于使用和環(huán)保，實(shí)現(xiàn)理想LAMP檢測(cè)的可行性取決于微型化檢測(cè)組件的發(fā)展，微流控芯片[51]作為下一代基因檢測(cè)設(shè)備一直被關(guān)注。該裝置是在平臺(tái)上組裝的微小通道構(gòu)成，在基因測(cè)試時(shí)，可以在單個(gè)芯片上進(jìn)行完整的分析，包括提取，擴(kuò)增和檢測(cè)[52]。這些器件稱為μ-總分析系統(tǒng)(μ-TAS)芯片，或稱為“芯片上的實(shí)驗(yàn)室”。使用這些裝置的優(yōu)點(diǎn)包括防止基因擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，根據(jù)設(shè)備的設(shè)計(jì)可以進(jìn)行多體系自動(dòng)化反應(yīng)，可以提高對(duì)微量樣品的分析速度，以及進(jìn)行簡(jiǎn)化及微型化現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試。這種方法可以解決與現(xiàn)場(chǎng)基因測(cè)試相關(guān)的大量問題。Hataoka等人[53]已經(jīng)通過研究證明，LAMP擴(kuò)增之后繼續(xù)進(jìn)行下一步的反應(yīng)和分析，這些都可以在單個(gè)芯片上實(shí)現(xiàn)，也證明LAMP反應(yīng)在下一代的設(shè)備裝置中依然適用。基于LAMP方法的簡(jiǎn)單通用的設(shè)備的開發(fā)和應(yīng)用，對(duì)臨床疾病的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)將具有重要意義。

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