張 記 吳玉章

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)全軍免疫學(xué)研究所，重慶 400038)

機體免疫系統(tǒng)具有防御、監(jiān)視及自穩(wěn)功能,其功能異常會導(dǎo)致傳染性疾病、自身免疫性疾病及惡性腫瘤等重大疾病的發(fā)生。機體的免疫應(yīng)答是通過一系列免疫細胞與免疫分子間的相互作用實現(xiàn)的。幾乎所有免疫細胞都是可移動的；信息在細胞的接觸中快速地傳遞,免疫細胞在不同組織器官之間遷移[1]。 免疫應(yīng)答相關(guān)分子的表達、空間轉(zhuǎn)位及相互作用等功能信息也是瞬息萬變的,在不同微環(huán)境中的功能具有時效性與差異性。因此，免疫細胞的運動、遷移及相互接觸等動態(tài)信息的獲取，對免疫應(yīng)答與免疫治療過程的直觀呈現(xiàn)及機理的系統(tǒng)性解析非常重要[2]。

顯微成像與流式細胞術(shù)等技術(shù)使免疫學(xué)家已獲得了大量免疫分子的結(jié)構(gòu)與功能信息，鑒定了很多重要的免疫細胞類型及其功能，極大地推動了免疫學(xué)的研究進程。但這些基于體外實驗獲得的數(shù)據(jù)，不能真實反映生物活體的精細結(jié)構(gòu)、生理及病理環(huán)境。由體外研究獲得的功能信息,需要在活體內(nèi)驗證。其次，基于靜態(tài)節(jié)點的研究方法只適合對免疫系統(tǒng)一個狀態(tài)的判斷,無法確定各狀態(tài)環(huán)節(jié)之間的銜接與發(fā)展。

1 雙光子活體成像實驗技術(shù)

分子成像技術(shù)及方法的發(fā)展,尤其是雙光子掃描顯微鏡的出現(xiàn)與改進，為活體狀態(tài)下免疫反應(yīng)的動態(tài)過程研究提供了可能。雙光子掃描顯微鏡技術(shù)具備以下4方面能力[3]：①高時空分辨率的三維成像；②多分子與細胞事件的并行檢測；③長時程動態(tài)監(jiān)測；④從亞微米到厘米的跨層次多尺度的系統(tǒng)性觀察?；谏鲜黾夹g(shù)，免疫應(yīng)答過程中多種類免疫細胞的遷移、募集與相互接觸的可視化成為可能。

1.1雙光子成像的原理及特點 1931年雙光子理論首先提出[4]：熒光分子在足夠短的時間內(nèi)遇上2個或多個光子，熒光分子就能同時吸收2個或多個光子。其物理學(xué)原理是：在單光子激發(fā)過程中，基態(tài)熒光分子在激光照射下吸收一個高能光子使分子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，隨后到達亞穩(wěn)態(tài)，最后從亞穩(wěn)態(tài)返回基態(tài)并發(fā)射出較長波長的熒光光子。單光子熒光激發(fā)過程只吸收一個光子，是一個線性吸收過程。在多光子激發(fā)過程中，熒光分子同時吸收多個光子實現(xiàn)基態(tài)到激發(fā)態(tài)的躍遷，從亞穩(wěn)態(tài)返回基態(tài)并發(fā)射出一個波長大于激發(fā)光波長1/n(雙光子n=2)的光子。雙光子熒光激發(fā)需要同時吸收2個光子，其躍遷概率跟激光功率成平方關(guān)系，所以雙光子吸收是一個非線性過程，只有在高光子密度情況下才會發(fā)生顯著的雙光子吸收過程。

基于以上原理，傳統(tǒng)的單光子激光共聚焦顯微鏡的局限性是：①單光子激發(fā)過程是線性激發(fā)，焦平面附近會產(chǎn)生熒光，導(dǎo)致成像時有較高的背景熒光，從而影響成像質(zhì)量。②單光子激發(fā)過程一般是用高光子能量的可見光波段激發(fā)，熒光染料會產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致光漂白與光毒性，損傷活體細胞，限制了其在活體組織中的使用。③為獲得高分辨率的成像，必須保證共聚焦的針孔足夠?。坏讖綔p小會阻擋掉大部分熒光。

而雙光子熒光激發(fā)是一個非線性過程，通常雙光子激光顯微鏡選擇近紅外光作為激發(fā)光，其特點如下[5]：①光損傷小。使用紅外波長(長波長)的脈沖飛秒激光作為光源激發(fā)，能顯著降低光損傷與光毒性；故雙光子顯微鏡對活體細胞及組織的光損傷很小，適合于長時程的觀察研究。②組織內(nèi)源性吸收少。生物組織對近紅外波段的內(nèi)源性吸收較少，是探測活體組織成像的理想光學(xué)窗口。③穿透能力強。近紅外光作為激發(fā)光，比單光子激發(fā)波長要長；在生物組織中，長波長的光比短波長的光受散射影響要小，從而容易穿透樣品；因而雙光子激光顯微鏡能達到更大的成像深度(200～1 000 μm)，可以對生物樣品進行深層的研究。④分辨率高。雙光子吸收截面很小，只在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)激發(fā)出熒光，局限于焦點處的體積很小的范圍內(nèi)。⑤光漂白小。漂白區(qū)域很小，焦點以外不發(fā)生漂白現(xiàn)象。⑥熒光收集效率高。與單光子共聚焦成像相比，雙光子成像不需要針孔，提高了熒光收集效率，直接導(dǎo)致圖像對比度提高。⑦適合多標記測量。許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜比單光子激發(fā)譜要寬，因此就可以利用單一波長的激發(fā)光同時激發(fā)多種染料，從而得到同一生命現(xiàn)象中的不同信息，便于相互對照補充。

1.2動物活體成像的實驗體系 實驗動物長時程的活體成像，除硬件設(shè)備雙光子顯微鏡外，其他必要的技術(shù)條件是：①熒光標記技術(shù)；②待觀察組織的暴露及固定技術(shù)。待觀察組織首先必須直接暴露在顯微鏡鏡頭下，這需要相應(yīng)的外科手術(shù)。其次，細胞運動的長時程成像，要求觀察視野必須是高度靜止的，不能受到動物心跳與呼吸的影響?；谝陨弦螅铙w成像的基本實驗設(shè)計原則是[6]：根據(jù)待觀察組織的解剖學(xué)位置、組織內(nèi)觀察深度、待觀察細胞種類、待觀察細胞運動速度、分辨率需求等因素選擇合適的激光顯微鏡、熒光搭配方案及合理的暴露手術(shù)。

1.2.1活體成像實驗的熒光標記 光學(xué)分子探針主要包括化學(xué)小分子探針、納米顆粒及遺傳編碼型分子探針等[6]。常用的分子探針是化學(xué)探針與遺傳編碼的熒光蛋白?；瘜W(xué)小分子探針由于其體積小且對生物分子功能的干擾小,在生命科學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。相對而言,基于熒光蛋白的遺傳編碼型分子探針,由于其準確的亞細胞定位能力、良好的生物相容性及光學(xué)信號不會隨細胞分裂而減少等特點,使活體內(nèi)數(shù)天至數(shù)月長時程、動態(tài)監(jiān)測蛋白質(zhì)分子事件成為可能。不同熒光的搭配使用，是實現(xiàn)活體內(nèi)多分子事件同步光學(xué)觀察的基礎(chǔ)。長期示蹤活細胞的熒光一般是CFSE(綠色)與 CMTMR(橙色)[4]。其他常用的遺傳編碼的蛋白標簽有藍色熒光蛋白(BFP)、青色熒光蛋白(ECFP)、綠色熒光蛋白(EGFP)、黃色熒光蛋白(EYFP)及紅色熒光蛋白(DsRed)等[7]。

1.2.2活體成像實驗組織暴露的外科手術(shù) 皮膚等組織的觀察，不需要或只需要很小的暴露手術(shù)即可實現(xiàn)。但對淋巴結(jié)、腦組織、乳腺組織、真皮組織，尤其是腹腔內(nèi)的組織(如肝臟、腸組織、胰腺組織等)則需要進行較大的外科暴露手術(shù)，并需要利用金屬環(huán)、金屬支架等進行固定，這個過程稱為開窗[8]。在進行開窗的外科手術(shù)中，不能有感染及炎癥出現(xiàn)，否則手術(shù)感染導(dǎo)致的炎癥細胞浸潤會影響實驗結(jié)果。開窗是非常具有挑戰(zhàn)性的外科手術(shù)，整個實驗過程對動物飼養(yǎng)環(huán)境、顯微成像實驗室環(huán)境均有很高要求。當實驗需要長達數(shù)天、數(shù)周觀察的時候，上述操作的要求則更為嚴苛[9]。針對上述組織，不同實驗室設(shè)計了多種開窗方案并取得了一定成功[10]。但手術(shù)中動物死亡、流血、窗口脫落、感染及組織輕微抖動等問題的出現(xiàn)，使成像實驗的失敗率很高。另一方面，動物在顯微鏡下觀察需要定制合適的載物臺，保證動物在觀察時間內(nèi)始終處于麻醉狀態(tài)。為了保證活體成像觀察數(shù)據(jù)的準確性及長時程觀察的動物生理機能處于正常水平，還需要保證載物臺的溫度等其他細節(jié)。

2 雙光子活體成像技術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用

免疫應(yīng)答的基本過程是:抗原呈遞細胞在外周捕獲抗原后運動到淋巴結(jié)，在淋巴結(jié)與T、B淋巴細胞接觸；活化的淋巴細胞進入循環(huán)系統(tǒng)并到達效應(yīng)器官發(fā)揮其免疫效應(yīng)。2002年3篇發(fā)表在Science 的研究將雙光子活體成像技術(shù)引入了免疫學(xué)領(lǐng)域。加州大學(xué)埃文斯分校的Cahalan團隊研究了活體內(nèi)淋巴結(jié)中T細胞與DC 細胞的相互作用過程[11]；NIH的Germain團隊成像了活體中淋巴結(jié)內(nèi)的T、B淋巴細胞的運動性及其抗原應(yīng)答過程[12]；加州大學(xué)伯克利分校的Robey團隊則在活體內(nèi)可視化了淋巴細胞發(fā)育過程中胸腺細胞與間質(zhì)細胞的相互作用[13]。在過去的16年中，活體成像技術(shù)應(yīng)用到了免疫學(xué)的諸多領(lǐng)域:從淋巴細胞的發(fā)育到免疫細胞的活化，從免疫細胞間的相互作用到效應(yīng)免疫細胞對靶細胞的殺傷。觀察對象從各級淋巴器官(骨髓、淋巴結(jié)、脾臟、胸腺等)到免疫細胞發(fā)揮效應(yīng)的各個器官(皮膚、肝臟、腦、肺等)；從機體的穩(wěn)態(tài)維持，到感染性疾病、自身免疫性疾病，從腫瘤免疫微環(huán)境的組成到免疫相關(guān)藥物的效應(yīng)機制。多種器官的開窗手術(shù)方法得到建立，多種免疫細胞的運動細節(jié)及功能相關(guān)性得到揭示。免疫應(yīng)答過程中多個新的關(guān)鍵性發(fā)現(xiàn)，加深或修正了我們對免疫學(xué)的理解?，F(xiàn)從技術(shù)運用的角度，以具體的研究實例為依據(jù)，概括總結(jié)本技術(shù)在解決免疫學(xué)相關(guān)科學(xué)問題中的應(yīng)用。

2.1可視化免疫細胞的運動規(guī)律，揭示其運動相關(guān)功能 CD4輔助性T細胞在控制胞內(nèi)寄生蟲感染中起著核心作用，但病原體特異性CD4 T細胞有效檢測到感染細胞的過程尚不清楚。Filipe-Santos等[14]利用Lys-EGFP工具鼠及表達DsRed熒光的利什曼原蟲感染模型，通過運用活體成像技術(shù)，描繪了感染部位CD4 T細胞的抗原識別動態(tài)圖譜。研究者發(fā)現(xiàn)，活化的CD4 T細胞進入發(fā)炎組織與抗原特異性無關(guān)，病原體特異性T細胞傾向于在真皮感染位置減速并聚集；CD4 T細胞的抗原識別是異質(zhì)性的，其與吞噬細胞既有穩(wěn)定接觸也有動態(tài)接觸；并非所有感染細胞都會引起病原體特異性CD4 T細胞的阻滯或減速；感染細胞的密集成簇造成移動的CD4 T細胞很難接近。

Th17細胞與自身免疫性神經(jīng)炎癥的神經(jīng)損傷相關(guān)，Siffrin等[15]利用雙光子活體成像追蹤了疾病特異性Th17在其動物模型EAE發(fā)病過程中的運動規(guī)律。他們發(fā)現(xiàn)疾病特異性Th17細胞與神經(jīng)元細胞在病變位點存在持續(xù)的直接相互作用，并誘導(dǎo)發(fā)生嚴重神經(jīng)損傷的早期信號。此發(fā)現(xiàn)突出了Th17細胞效應(yīng)功能在神經(jīng)元功能失常中的中心作用。

效應(yīng)CD8 T細胞(CD8 TE)在嗜肝病毒感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在小鼠HBV感染的模型中，Guidotti等[16]利用雙光子成像技術(shù)追蹤了CD8 TE細胞歸巢到肝臟、識別抗原及展開其效應(yīng)功能的過程。他們發(fā)現(xiàn)，循環(huán)CD8 TE“停泊”在血小板滯留的肝竇中；在滯留的早期，CD8 TE主動沿著肝血竇爬行，穿過內(nèi)皮窗孔并延長胞質(zhì)突起而探測血竇下方肝細胞存在的抗原；而肝細胞的抗原識別則通過滲出非依賴的方式引起CD8 TE的效應(yīng)功能。

Liew等[17]利用活體成像技術(shù)，在肝臟無菌損傷模型中追蹤iNKT細胞從損傷發(fā)生到損傷恢復(fù)整個過程的運動規(guī)律。其發(fā)現(xiàn)，iNKT在自身抗原驅(qū)動下，相當于損傷感知的檢測器與調(diào)節(jié)器：iNKT對無菌損傷的反應(yīng)分為排斥、滯留及浸潤3個明顯的階段?！把策墶钡膇NKT細胞最初排斥在肝損傷位點，隨后被損傷位點通過自身抗原與細胞因子捕獲，最后環(huán)繞在損傷位點。自身抗原對iNKT的活化產(chǎn)生IL-4，而非IFN-γ，促進肝細胞增殖，改善損傷愈合。與此類似，Wang等[18]則利用活體成像技術(shù)追蹤肝損傷與修復(fù)過程中的中性粒細胞的時空運動軌跡、可視化中性粒細胞的功能與命運。他們發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞在無菌肝損傷模型中會穿透損傷位點，在“拆除”損傷血管及新血管再生中扮演關(guān)鍵角色。在完成上述任務(wù)后，其不是在損傷位點死亡或被吞噬；相反，許多中性粒細胞再次進入脈管，執(zhí)行預(yù)先“安排”的運動過程：在肺內(nèi)逗留一段時間后上調(diào)CXCR4，最后進入骨髓并在骨髓內(nèi)凋亡。

在腫瘤免疫中，浸潤在實體瘤中的CTL與NK細胞是最重要的殺傷細胞，但兩者浸潤、清除腫瘤細胞的動力學(xué)過程未知。Boissonnas等[19]利用活細胞成像技術(shù)對CTL的運動規(guī)律進行追蹤，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的抗原表達決定CTL在腫瘤內(nèi)的運行規(guī)律及深層浸潤?；罨腃TL 以極快的速度遷移，在距離表達同源抗原的腫瘤細胞很近的位置停止運動，而在腫瘤細胞死亡的區(qū)域CTL重新遷移。沿著血管遷移的CTL傾向于采用一種細長形態(tài)。當腫瘤細胞表達同源抗原時，CTL也會遷移到腫瘤深處；在無同源抗原的區(qū)域，CTL的浸潤限制在腫瘤表面區(qū)域，并且既不停止運動也不殺傷細胞。Breart等[20]進一步在CTL過繼轉(zhuǎn)移導(dǎo)致腫瘤消退的模型中發(fā)現(xiàn)，過繼轉(zhuǎn)移的CTL導(dǎo)致腫瘤消退主要是通過CTL對單個腫瘤細胞直接作用，僅有極小的旁觀效應(yīng)。令人吃驚的是，單個CTL殺傷一個靶細胞需要很長時間，平均需要6 h。Deguine等[21]則利用本技術(shù)發(fā)現(xiàn)NK 細胞與CTL在腫瘤消退階段具有完全不同的與靶細胞接觸的動力學(xué)特征。他們發(fā)現(xiàn)，NKG2D配體驅(qū)動NK細胞在浸潤腫瘤的活化與運動特征。在腫瘤收縮過程中，NK 細胞具有與其靶標動態(tài)接觸的過程；與NK細胞相反，CTL 與表達其抗原的腫瘤細胞則形成穩(wěn)定的接觸。

2.2可視化免疫細胞之間的相互作用，揭示其時空關(guān)系 活體成像技術(shù)的主要優(yōu)勢是能觀察分子與細胞在空間上的關(guān)系及時間上的聯(lián)系，得到完整的動態(tài)過程。在免疫應(yīng)答啟動過程中，二級淋巴器官中存在著多種免疫細胞之間的相互作用，多是通過細胞間的相互接觸實現(xiàn)的；其接觸特征、接觸時間的長短、運動的速度等參數(shù)與整個免疫應(yīng)答的質(zhì)量及結(jié)局密切相關(guān)。其他技術(shù)只能觀察到各時間點上的橫斷面，且非是嚴格的同一位置。各時間點之間的關(guān)系、各位置之間的聯(lián)系，是通過邏輯推理完成的，其中難免沒有謬誤。因此，活體成像是研究免疫細胞間相互作用的利器，是其他技術(shù)無法替代的。

在病毒感染的免疫應(yīng)答啟動過程中，樹突狀細胞(DC)亞群、輔助性CD4 T與效應(yīng)性CD8 T細胞在淋巴結(jié)內(nèi)發(fā)生著復(fù)雜的、動態(tài)的相互接觸及相互作用，最終實現(xiàn)CD8 T細胞的克隆擴增、分化及記憶反應(yīng)。雙光子活體成像技術(shù)在揭示此類涉及時空轉(zhuǎn)換過程的免疫應(yīng)答機理中具有天然的優(yōu)勢。Eickhoff等[22]利用活體成像顯微鏡的淋巴結(jié)大視野成像發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)內(nèi)的CD4 T與CD8 T的初始啟動在空間上是分開的；并且依賴于不同的DC亞群及不同的抗原呈遞模式。在另一項研究中，Hor等[23]則發(fā)現(xiàn)了CD4 T與CD8 T的活化在時間上的不同步性。在免疫應(yīng)答早期，CD4 T 與遷移來的皮膚DC成簇而發(fā)生相互接觸，而CD8 T則不與遷移來的DC相互接觸，其活化是延遲的；而在免疫應(yīng)答后期，CD8 T與淋巴結(jié)定植的XCR1+DC成簇，并進而與已致敏的CD4 T發(fā)生相互接觸，完成CD4 T對CD8 T活化的輔助。兩項研究同時發(fā)現(xiàn)，XCR1+DC亞群是實現(xiàn)CD4 T 輔助CD8 T 應(yīng)答的關(guān)鍵平臺。類似的，B細胞與Tfh細胞在淋巴結(jié)生發(fā)中心的相互作用決定了體液免疫的質(zhì)量。清華大學(xué)祁海團隊[24]利用雙光子活體成像技術(shù)揭示了影響兩者相互作用的分子Ephrin-B1介導(dǎo)的機制。他們發(fā)現(xiàn)，生發(fā)中心B細胞高表達Ephrin-B1分子；Ephrin-B1以接觸依賴的方式通過Tfh細胞上表達的EphB6受體排斥Tfh細胞，抑制抗原特異的Tfh-B細胞黏附互作，進而限制Tfh細胞在生發(fā)中心的停留時間。于是，在無Ephrin-B1的生發(fā)中心里，盡管有過量Tfh細胞，也無法產(chǎn)生足夠的漿細胞。

本技術(shù)還能夠揭示效應(yīng)器官中免疫細胞運動之間的聯(lián)系。趨化因子在病毒感染過程中招募活化的效應(yīng)T細胞進入感染部位，但其招募T細胞的機制未知。Lim等[25]發(fā)現(xiàn)，氣管中性粒細胞的運動軌跡“指導(dǎo)”了流感特異性CD8 T細胞的運動。他們借助于雙光子成像技術(shù)，觀察了流感病毒感染氣管的中性粒細胞及CD8 T細胞運動的動態(tài)軌跡，發(fā)現(xiàn)中性粒細胞遷移留下持久的、富含CXCL12的痕跡，CD8 T 細胞沿著此軌跡到達感染部位。Bartholo-maus等[26]則利用此技術(shù)成像了中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變中效應(yīng)CD8 T細胞與大腦結(jié)構(gòu)之間的相互作用過程。中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織通常既不允許細胞通過，也不允許血液中大多數(shù)分子通過，其特化的血管能有效屏蔽血液循環(huán)。研究者在EAE大鼠模型中，成像了從CD8 T到達到腦組織到出現(xiàn)疾病癥狀，整個過程中CD8 T細胞與大腦結(jié)構(gòu)之間的相互作用：CD8 T細胞到達軟腦膜血管后停止運動并開始監(jiān)視腔面，且其偏好于逆血流方向爬行，對外腔血管表面及其下方軟腦膜進行持續(xù)掃描；在此處CD8 T細胞遇到呈遞外源性抗原與髓鞘抗原的吞噬細胞；此接觸刺激效應(yīng)T細胞產(chǎn)生炎癥因子，為其組織侵襲及炎癥浸潤提供觸發(fā)信號。

2.3探究免疫應(yīng)答分子細胞機制的有力工具 現(xiàn)代科學(xué)的證明邏輯非常強調(diào)“眼見為實”?；铙w雙光子成像技術(shù)所獲取的實驗數(shù)據(jù)屬于直接證據(jù)，其邏輯強度強于其他間接證據(jù)。雙光子成像技術(shù)結(jié)合基因敲除小鼠等手段，在闡述基礎(chǔ)免疫現(xiàn)象的細胞機理方面、在解析免疫相關(guān)疾病的分子機制方面及在探究免疫相關(guān)藥物的工作機理方面，均有著重要的應(yīng)用。

2.3.1解析基礎(chǔ)免疫現(xiàn)象 睪丸、毛囊及胎盤均是免疫抑制微環(huán)境，多種機制共同阻止免疫攻擊，保證了此處異體移植物的長期存活。與上述器官不同，骨髓內(nèi)的微環(huán)境是存在免疫反應(yīng)的，但此處異源性移植的存活效率依然等同于同源移植，此處免疫豁免的機理不得而知。Fujisaki等[27]利用高分辨活體成像技術(shù)揭開了其機理。他們發(fā)現(xiàn)活體中造血干細胞與Treg 細胞存在明顯的共定位：二者聚集在顱蓋骨及小梁骨骨髓的骨內(nèi)膜表面，形成一種局部區(qū)域，此區(qū)域成為應(yīng)付免疫攻擊的“避難所”。

Sap基因敲除小鼠及其對應(yīng)的人類疾病均具有明顯的生發(fā)中心形成缺陷現(xiàn)象，但機制未知。祁海等[28]利用雙光子活體成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)：Sap缺陷不破壞CD4 T與抗原遞呈細胞DC的穩(wěn)定接觸能力，但破壞CD4 T 與其同源B細胞的穩(wěn)定接觸能力，導(dǎo)致抗原特異性B細胞不能接收到適當水平的T細胞輔助；而Sap缺陷T細胞由于缺乏與B細胞穩(wěn)定的相互作用，造成其不能有效招募并保留在新生的生發(fā)中心，進而不能維持生發(fā)中心反應(yīng)。這為Sap缺乏導(dǎo)致生發(fā)中心缺陷提供了合理的分子解釋。

在黏膜免疫領(lǐng)域，雙光子成像技術(shù)也有重要應(yīng)用。腸道固有層DC(LP-DC)分為兩個亞群，一群是傾向誘導(dǎo)耐受，另一群偏好誘導(dǎo)炎癥，但兩者捕獲腸道抗原的機制知之甚少。Mcdole等[29]用一種破壞性極小的腸道組織活體成像方法，可視化了腸道杯狀細胞傳送抗原的過程。他們發(fā)現(xiàn)：小腸杯狀細胞在穩(wěn)態(tài)下，可作為從腸腔傳送低分子量、可溶性抗原到其底面的LP-DC的通道，并偏好于把抗原遞送給耐受DC,而非炎癥DC。此發(fā)現(xiàn)突出了杯狀細胞在腸道免疫自穩(wěn)中的重要功能。

2.3.2闡述免疫病理的分子細胞機制 全身感染或炎癥會導(dǎo)致學(xué)習(xí)及認知功能受損，其機制知之甚少。Garre等[30]用雙鏈RNA類似物poly(I∶C) 模擬病毒感染的免疫激活，用雙光子顯微鏡長時程對小鼠主要運動皮質(zhì)第V層錐體神經(jīng)元突觸后樹突棘成像。他們發(fā)現(xiàn)，外周免疫激活導(dǎo)致樹突棘丟失，損害學(xué)習(xí)依賴性樹突棘的形成。并進一步發(fā)現(xiàn)，上述觀察到的皮層突觸的改變是由外周單核細胞通過TNF-α依賴機制破壞運動及學(xué)習(xí)相關(guān)樹突棘的可塑性產(chǎn)生，而非通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生。免疫復(fù)合物沉積導(dǎo)致的組織損傷是諸多自身免疫病發(fā)病的基礎(chǔ)。中性粒細胞是最早招募到復(fù)合物沉積位點的細胞，在塑造組織免疫應(yīng)答中扮演關(guān)鍵作用，但其與發(fā)病過程的關(guān)系并不清楚。Miyabe等[31]利用多光子活體成像技術(shù)及多種基因敲除小鼠，對免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎成像，揭開了整個復(fù)雜過程的細節(jié)及相關(guān)機理：補體 C5a直接致使中性粒細胞黏附在關(guān)節(jié)內(nèi)膜并啟動炎癥，且其受體C5aR是中性粒細胞黏附的關(guān)鍵分子；此黏附進而導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)皮β2 整合素依賴的中性粒細胞捕獲，并造成中性粒細胞爬行方向的改變。進一步，BLT1介導(dǎo)第一批中性粒細胞滲出血管，隨后CCR1促進中性粒細胞在關(guān)節(jié)內(nèi)皮爬行，而CXCR2則放大晚期中性粒細胞的招募及其在關(guān)節(jié)內(nèi)的存活。

2.3.3探究免疫相關(guān)藥物的效應(yīng)機理 CD20單抗能有效治療B細胞腫瘤，但其導(dǎo)致B細胞清除的細節(jié)并不清楚。Montalvao等[32]利用活體成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝臟是B細胞清除的主要位置，枯否細胞(KC)介導(dǎo)肝臟血竇內(nèi)循環(huán)B細胞的瞬時捕獲及吞噬。此發(fā)現(xiàn)解釋了B細胞數(shù)量在二級淋巴結(jié)下降的原因。

PD-1抗體(aPD-1)在多種實體瘤中的有效性已得到證實。但aPD-1總體應(yīng)答率低，如何提高aPD-1效果與應(yīng)答范圍極其重要。對aPD-1效應(yīng)機制的解析有利于進一步提高藥物效果。Arlauckas等[33]利用活體成像技術(shù)，亞細胞分辨率揭示aPD-1的實時命運與活性狀態(tài)。其發(fā)現(xiàn)aPD-1在注射后的早期，能有效結(jié)合PD-1陽性腫瘤浸潤CD8 T，但此結(jié)合非常短暫，幾分鐘后aPD-1被PD-1陽性腫瘤相關(guān)巨噬細胞捕獲。他們進一步展示，巨噬細胞捕獲aPD-1 依賴于藥物Fc結(jié)構(gòu)域多糖及宿主髓樣細胞Fcγ受體。在注射aPD-1之前阻斷Fcγ受體，可以很大程度延長aPD-1與腫瘤浸潤CD8 T的結(jié)合時間，進而增強aPD-1的治療效果。

2.4發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)象，修訂舊觀點 活體成像技術(shù)的長時程、大視野觀察可以發(fā)現(xiàn)諸多細胞層次上有趣現(xiàn)象?；铙w成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)了中性粒細胞成群“蜂擁”密集招募于感染位點的現(xiàn)象[34]。中性粒細胞從血液招募到損傷位點是早期固有免疫應(yīng)答的特征之一。中性粒細胞滲出血管后，展現(xiàn)出極度協(xié)調(diào)的趨化性，并出現(xiàn)“成簇”現(xiàn)象，其特征類似于昆蟲的密集“蜂擁”行為。Lammermann等[35]利用雙光子顯微鏡技術(shù)揭示了上述局部死亡細胞信號長距離傳播的分子機制；并發(fā)現(xiàn)中心粒細胞密集成群行為協(xié)同膠原纖維等形成一個有邊緣的、緊密的傷口“密封”，此“密封”實現(xiàn)了把感染部位從周圍正常組織區(qū)分出來的效果。

祁海團隊在淋巴結(jié)生發(fā)中心發(fā)現(xiàn)了T-B 細胞“糾纏”現(xiàn)象[36]。利用雙光子顯微活體成像技術(shù)，他們發(fā)現(xiàn)生發(fā)中心里T-B細胞互作與其他組織部位不同，每次互作時間很短，但胞膜接觸面積很大，使T細胞可以通過這種接觸面迅速向B細胞胞吐傳遞預(yù)先已經(jīng)準備好的促增殖、促存活的輔助信號。通過這種“糾纏”般短暫而頻繁的接觸，T細胞可以更容易鑒別哪些B細胞是高親和力的，使這些B細胞積攢更多輔助信號。他們還發(fā)現(xiàn)，B細胞表達ICOSL配體，通過刺激T細胞的ICOS受體促進T細胞鈣響應(yīng)，進而增大糾纏互作中T-B細胞的接觸面積及T細胞通過胞吐傳遞輔助信號的效率。

Woodruff等[37]則在流感疫苗接種中發(fā)現(xiàn)了淋巴結(jié)定植DC(LN-DC)的跨節(jié)點遷移現(xiàn)象。在疫苗接種中，LN-DC的合適刺激與接種免疫的有效性密切相關(guān)。利用小鼠的滅活流感疫苗模型結(jié)合全淋巴結(jié)成像方法，其觀察到LN-DC在疫苗接種幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生跨淋巴結(jié)節(jié)點的復(fù)位，進入到特異抗原收集位點。LN-DC在到達特異抗原收集位點后獲取病毒抗原，啟動病毒特異性CD4 T 細胞活化；并可以在缺少皮膚DC的情況下，導(dǎo)致生發(fā)中心形成及產(chǎn)生B細胞記憶。此揭示了LN-DC在快速定位病毒抗原、驅(qū)動T細胞群體早期活化中的重要地位。

華中科技大學(xué)張智紅團隊則利用長時程活體成像發(fā)現(xiàn)了實體瘤微環(huán)境中的“免疫抑制環(huán)”現(xiàn)象[38]。該團隊利用多色熒光活體成像技術(shù)觀察了黑色素瘤聯(lián)合免疫治療中的關(guān)鍵細胞事件。他們發(fā)現(xiàn)，Treg 細胞在實體腫瘤周圍形成一個免疫抑制環(huán)；聯(lián)合免疫治療能減輕免疫抑制、引起浸潤的內(nèi)源性免疫細胞瞬間活化、促進CTL聚集并加速DC浸潤。

Gabanyi等[39]發(fā)現(xiàn)了腸道內(nèi)肌肉層巨噬細胞的快速活化現(xiàn)象。小腸組織中存在著多種類型巨噬細胞，固有層巨噬細胞是靠近小腸壁的一群細胞，而肌層巨噬細胞則位于小腸組織的深層部位。利用多光子活體顯微鏡及多種熒光報告小鼠，他們觀察到兩群巨噬細胞不僅形態(tài)與細胞運動方面存在差異，其周圍小腸神經(jīng)元分布也存在差異。肌層巨噬細胞與活化的神經(jīng)元密切相關(guān)，其表面受體對神經(jīng)元產(chǎn)生的去甲腎上腺素信號產(chǎn)生應(yīng)答。利用本技術(shù)可以動態(tài)觀察的特點，他們還發(fā)現(xiàn)肌層巨噬細胞能在感染后1～2 h內(nèi)激活，明顯快于完全依賴免疫系統(tǒng)的應(yīng)答過程。

活體成像技術(shù)修訂了CTL殺傷靶細胞的部分認知。體外實驗數(shù)據(jù)表明T 細胞能快速有效的殺傷靶細胞，但Halle等[40]則發(fā)現(xiàn)活體內(nèi)CTL對病毒感染細胞的殺傷效率并非如此高。他們在小鼠病毒感染模型中利用雙光子活體成像，通過實時成像及數(shù)學(xué)模型分析定量了CTL介導(dǎo)的殺傷效率：平均1個CTL 1 d時間殺傷1～16個病毒感染細胞；而病毒誘導(dǎo)MHCⅠ分子下調(diào)后，CTL則不能破壞其靶細胞。他們還發(fā)現(xiàn)CTL在殺傷過程中不與靶細胞形成穩(wěn)定突觸，且每個CTL 在功能上具有強烈的異質(zhì)性。

3 小結(jié)與展望

雖然雙光子熒光顯微成像技術(shù)有著諸多優(yōu)點，但過高的平臺要求及技術(shù)要求，使其沒有像共聚焦顯微鏡那樣得到非常普遍的應(yīng)用，可謂是一個貴族技術(shù)。首先，其需要昂貴的顯微鏡配置平臺，通常需要1～2臺雙光子顯微鏡及1臺共聚焦顯微鏡相配合。其次，需要根據(jù)待成像免疫器官及疾病器官的不同，設(shè)計、定制個性化的載物臺及固定裝置。第三，需要多種熒光報告工具小鼠。第四，需要長時間的工具鼠與基因敲除小鼠的雜交。第五，需要強調(diào)的是，雙光子活體成像技術(shù)作為一種影像學(xué)技術(shù)，其仍需與其他技術(shù)聯(lián)合才能完整地完成科學(xué)問題的證明。

在免疫學(xué)領(lǐng)域，到目前為止全球僅有十余家實驗室可以穩(wěn)定使用本技術(shù)高效產(chǎn)出。但隨著技術(shù)的逐步積累，雙光子活體成像技術(shù)會得到進一步的普及。雙光子活體成像技術(shù)動態(tài)可視化的特點，必將使其在現(xiàn)代生命科學(xué)的諸多領(lǐng)域具有更為廣泛而深入的應(yīng)用。

致謝：感謝華中科技大學(xué)張智紅教授及其團隊的技術(shù)培訓(xùn)。