夏 燕 陸光輝 黃 瓊 田 瑞 向 陽 向詩非 連思懿 向方華 袁 林

(湖北民族學(xué)院風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，恩施 445000)

原發(fā)性痛風(fēng)是由于單鈉尿酸鹽晶體沉積在關(guān)節(jié)及周圍結(jié)締組織而引起的炎癥反應(yīng)。 其中，高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)生和痛風(fēng)石形成的生化基礎(chǔ)，然而并不是所有的高尿酸血癥患者最終都會發(fā)展為原發(fā)性痛風(fēng)。研究表明，除了飲食、肥胖等后天因素外，遺傳因素是痛風(fēng)和高尿酸發(fā)病的另一個重要因素[1,2]。多個全基因組關(guān)聯(lián)研究顯示，尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因多態(tài)性與血尿酸水平升高和痛風(fēng)相關(guān)[3-5]。ABCG2 基因是編碼表達(dá)于腎近曲小管刷狀緣膜上的重要尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因[6]，研究顯示，ABCG2 基因多態(tài)性與血尿酸水平升高和痛風(fēng)發(fā)病密切相關(guān)，其中Q126X(rs72552713)和Q141K(rs2231142)兩個錯意突變位點(diǎn)，在前期研究中被認(rèn)為是原發(fā)性痛風(fēng)及高尿酸血癥的易感位點(diǎn)[7-9]，SNP rs3114018是ABCG2另一個錯意性突變位點(diǎn)，近來有研究發(fā)現(xiàn)其可能與痛風(fēng)發(fā)生相關(guān)[10-12]，但是其與高尿酸血癥的相關(guān)性研究未見報(bào)道。湖北恩施土家族苗族自治州地處武陵山區(qū)，痛風(fēng)和高尿酸血癥的發(fā)病率逐年上升。本研究欲探索武陵山地區(qū)人群中ABCG2基因單核苷酸位點(diǎn)rs3114018多態(tài)性與原發(fā)性痛風(fēng)、高尿酸血癥的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1研究對象 選擇2015年10月至2016年12月在湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院體檢中心體檢的高尿酸血癥、風(fēng)濕免疫科的原發(fā)性痛風(fēng)患者及同期無高尿酸血癥及痛風(fēng)家族病史的健康體檢者為研究對象，共452例，其中高尿酸血癥188例，男性147例；痛風(fēng)患者158例，男性153例；健康對照組106例，男性53例。高尿酸血癥均經(jīng)過臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查確診，男性血清尿酸≥416.4 μmol/L，女性血清尿酸≥356.9 μmol/L，且排除明確診斷痛風(fēng)、腫瘤、腎功能不全、嚴(yán)重全身系統(tǒng)性疾病及近期服用過容易引起血尿酸水平上升藥物的患者。痛風(fēng)患者均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會制定的原發(fā)性痛風(fēng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除腎臟疾病、腫瘤等引發(fā)的繼發(fā)性痛風(fēng)患者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均知情同意。

1.2方法

1.2.1臨床資料采集、生化指標(biāo)檢測 分別用抗凝管和分離膠管采集各受試人群空腹靜脈血 3 ml，其中分離膠管采集血液由醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測分析肝腎功能及血常規(guī)。

1.2.2DNA 提取 取空腹靜脈血EDTA-K2抗凝，3 000 r/min 離心3 min，采用離心吸附柱法，按照TIANamp Blood DNA Kit(天跟公司) 說明書操作提取 DNA，提取的 DNA 樣品用One Drop超微量紫外分光光度計(jì)(南京五義科技有限公司)檢測，吸光度(A260/280 nm) 值在 1.5～2.0，濃度 >50 ng/μl的 DNA 樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3基因多態(tài)性檢測 本實(shí)驗(yàn)采用Hi-SNP結(jié)合多重PCR技術(shù)和高通量測序技術(shù)(上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司)根據(jù) GenBank 中 ABCG2 基因序列，用在線Primer 3.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物序列:5′-CCTTCAGCCACTGAGGAAAAG-3，下游引物序列:5′-ACTCTTTCTTGGGTACTTTAGCTCTA-3′。在單管內(nèi)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，不同的樣本以不同的Barcode引物區(qū)分。混合樣本后，在Ion Proton/illumina 主流測序平臺上，對擴(kuò)增子進(jìn)行高通量測序。

2 結(jié)果

2.1ABCG2基因rs3114018(A/C)位點(diǎn)的HWE平衡檢驗(yàn) 結(jié)果顯示ABCG2基因的rs3114018位點(diǎn)在各組中均符合Hardy-Weinberg平衡(高尿酸血癥、痛風(fēng)和健康對照組χ2值分別為0.366、0.005和0.942，P值均大于0.05)，因此樣本具有群體代表性。

2.2臨床資料分析 痛風(fēng)組和高尿酸組與正常組間三酰甘油和總膽固醇差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。原發(fā)性痛風(fēng)和高尿酸血癥組血糖、 血肌酐、白細(xì)胞、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶均顯著高于正常組(P<0.05)。而原發(fā)性痛風(fēng)組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血肌酐、總膽固醇和白細(xì)胞與高尿酸組相比有顯著差異(結(jié)果見表1～3)。

2.3ABCG2基因rs3114018多態(tài)性與痛風(fēng)和高尿酸易感性的關(guān)聯(lián)分析 高尿酸血癥組rs3114018 位點(diǎn)AA、AC、CC基因型頻率分別為12.76%、 43.09%、 44.15%；正常組中其基因型頻率分別為15.09%、48.12%、36.79%，兩組基因型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.536，P=0.464)。采用Logtistic回歸比較分析，發(fā)現(xiàn)CA和CC基因型均未增加高尿酸血癥患病風(fēng)險(xiǎn)。痛風(fēng)組ABCG2基因rs3114018位點(diǎn)AA、AC、CC基因型頻率分別為 4.41%、32.70%、62.89%，與對照組基因型頻率分布相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.52，P< 0.001)(表4)。采用Logistic回歸比較分析，發(fā)現(xiàn)CC基因型使得發(fā)生痛風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)提高了5.861倍(95%CI:2.239～15.340,P<0.001)，其中C等位基因型與痛風(fēng)發(fā)生的相關(guān)性為2.461(95%CI:1.671～3.622,P<0.001)。對性別因素進(jìn)行校正,校正后rs3114018位點(diǎn)CC基因攜帶者痛風(fēng)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提高了5.540倍(結(jié)果見表5)。

2.4ABCG2基因 rs3114018多態(tài)性與痛風(fēng)易感性的關(guān)聯(lián)分析 rs3114018基因型AA、AC和CC在痛風(fēng)組和高尿酸血癥組中基因頻率分布存在顯著差異(χ2=14.91，P=0.001)，痛風(fēng)組C等位基因頻率占79.25%，較高尿酸血癥組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.666，P<0.001)。經(jīng)過分析，rs3114018 CC基因型使痛風(fēng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加了4.131倍(95%CI:1.695～10.067,P=0.002)，C等位基因能夠使痛風(fēng)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加1.994倍(95%CI：1.413～2.815，P<0.001)，而AC基因型與痛風(fēng)發(fā)生沒有顯著相關(guān)性。調(diào)整性別影響因素后，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(結(jié)果見表6)。

表1高尿酸組與正常組臨床資料比較

Tab.1Comparisonofsubjectcharacteristicsofhyperuricemiagroupwithcontrol

GroupsALT(U/L)AST(U/L)CREA(μmol/L)TC(mmol/L)GLU(mmol/L)TG(mmol/L)WBC(×109/L)Control20 35±1 5720 24±0 6973 63±1 434 91±0 175 04±0 061 70±0 415 62±0 18Hyperuricemia36 38±1 7427 93±0 9986 73±1 285 16±0 075 38±0 062 09±0 106 35±0 11t6 816 356 421 433 471 323 48P0 0000 0000 0000 1520 0010 1870 001

表2痛風(fēng)組與正常組臨床資料比較

Tab.2Comparisonofsubjectcharacteristicsofgoutgroupwithcontrol

GroupsALT(U/L)AST(U/L)CREA(μmol/L)TC(mmol/L)GLU(mmol/L)TG(mmol/L)WBC(×109/L)Control20 35±1 5720 24±0 6973 63±1 434 91±0 175 04±0 061 70±0 415 62±0 18Gout30 16±1 5426 97±1 25102 09±2 934 83±0 105 63±0 112 18±0 206 99±0 23t4 434 698 710 364 541 104 59P0 0000 0000 0000 7140 0000 2710 000

表3痛風(fēng)組與高尿酸組臨床資料比較

Tab.3Comparisonofsubjectcharacteristicsofgoutgroupwithhyperuricemiagroups

GroupsALT(U/L)AST(U/L)CREA(μmol/L)TC(mmol/L)GLU(mmol/L)TG(mmol/L)WBC(×109/L)Hyperuricemia36 38±1 7427 93±0 9986 73±1 285 16±0 075 38±0 062 09±0 106 35±0 11Gout30 16±1 5426 97±1 25102 09±2 934 83±0 105 63±0 112 18±0 206 99±0 23t2 5250 5675 1352 5161 8890 3742 542P0 0120 5710 0000 0130 060 7090 012

表4高尿酸組、痛風(fēng)組與正常組ABCG2基因rs3114018位點(diǎn)基因型等位基因頻率分布的比較

Tab.4Comparisonofdistributionofalleleofrs3114018ofgoutandhyperuricemiagroupwithcontrol

GroupsGenotype(n)CCACAAχ2PAllele(ratio)CAχ2PControl395116129(60 85%)83(39 15%)Gout10052720 52<0 001252(79 25%)66(20 75%)21 30<0 001Hyperuricemia8381241 690 430247(65 69%)129(34 31%)1 3790 240

表5ABCG2基因rs3114018多態(tài)性與痛風(fēng)和高尿酸易感性

Tab.5Associationbetweenhyperuricemiaandgoutandgenepolymorphismswithcontrolwhilecontrollingsex

ParameterOR95%CILowerUpperPOR1)95%CI1)LowerUpperP1)HyperuricemiaAC1 0590 5142 1820 8770 9730 4562 0770 943CC1 4190 6782 9680 3531 3400 6192 9040 458AC+CC1 2150 6142 4050 5761 1310 5532 3140 735GoutAC2 3310 8856 1390 0872 0500 6816 1720 202CC5 8612 23915 3400 0005 5401 83416 7350 002AC+CC3 8601 5309 7420 0043 5071 22310 0550 020

Note：1)Adjusted for sex.

表6ABCG2基因rs3114018多態(tài)性與痛風(fēng)易感性的關(guān)聯(lián)分析

Tab.6Associationbetweengoutandgenepolymorphismswithhyperuricemiawhilecontrollingsex

GnetypeOR95%CILowerUpperPOR1)95%CI1)LowerUpperP1)AC2 2010 8855 4740 0902 1090 8305 3550 117CC4 1311 69510 0670 0024 0491 62610 0840 003AC+CC3 7481 6118 7200 0023 0801 2657 5030 013

Note：1)Adjusted for sex.

3 討論

ATP結(jié)合盒蛋白亞家族G成員2(ATP-binding cassette,subfamily G,member 2,ABCG2)是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一員，基因位于4q22.1，長67 171 bp，編碼655個氨基酸，相對分子量72 343，最早被認(rèn)識是因其參與了腫瘤細(xì)胞的耐藥性產(chǎn)生，因此又被稱為乳腺癌耐藥蛋白(Breast cancer resistance protein BCRP,BCRP)，是導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥的重要機(jī)制之一[13]，Woodward等[14]研究證實(shí)ABCG2作為一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及尿酸分泌蛋白，廣泛分布在具有分泌和排泄功能的組織?，F(xiàn)在多項(xiàng)對 ABCG2 的全基因組關(guān)聯(lián)研究證實(shí) ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與體內(nèi)血尿酸水平和痛風(fēng)發(fā)病率之間存在相關(guān)性，其功能紊亂會增加痛風(fēng)和高尿酸血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[15-17]。Nakayama等[18]研究發(fā)現(xiàn)除了性別因素外，基因變異引起的ABCG2功能障礙對高尿酸血癥的發(fā)展影響要比其他常見的危險(xiǎn)因素如肥胖和酗酒等要大得多。rs3114018是ABCG2基因的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，定位于ABCG2 基因的內(nèi)含子區(qū)域，ABCG2基因rs3114018單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)對ABCG2基因功能的影響尚不清楚，研究認(rèn)為雖然內(nèi)含子區(qū)域不直接參與蛋白的編碼，但是其可能通過影響RNA的剪接，從而影響ABCG2蛋白的功能或表達(dá)[19]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)患者rs3114018基因多態(tài)性與尿酸水平間存在顯著相關(guān)性，攜帶CC基因型的痛風(fēng)患者尿酸水平明顯高于AA/AC基因型患者[10],Yu等[12]研究發(fā)現(xiàn)與正常組相比，C等位基因可能使痛風(fēng)發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)增加。本研究發(fā)現(xiàn)ABCG2基因rs3114018位點(diǎn)多態(tài)性與恩施地區(qū)痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)，與高尿酸血癥沒有顯著的相關(guān)性。痛風(fēng)組AA、AC、CC基因型與正常組和高尿酸血癥組相比有明顯差異，其中C等位基因型與痛風(fēng)發(fā)生具有相關(guān)性，CC基因型攜帶者與對照組相比痛風(fēng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)提高了5.861倍，與高尿酸組相比痛風(fēng)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提高了4.131倍。為了去除混雜因素對基因與痛風(fēng)的影響，調(diào)整了痛風(fēng)組與正常組中性別、血糖、 肌酐、白細(xì)胞、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶等差異因素，發(fā)現(xiàn)CC基因型與痛風(fēng)仍具有相關(guān)性(OR=7.505，95%CI：1.884～29.905,P=0.004)；同時(shí)調(diào)整痛風(fēng)組和高尿酸血癥組中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、血清總膽固醇和白細(xì)胞等差異因素后，CC基因型仍然使痛風(fēng)發(fā)病的危險(xiǎn)性上升了3.039倍(95%CI:1.064～8.681,P=0.038)。而對比分析高尿酸血癥與正常組發(fā)現(xiàn)，兩組基因型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CA和CC基因型均未增加高尿酸血癥患病風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)，C等位基因也與高尿酸血癥的發(fā)生沒有明顯相關(guān)性。

由此我們推測ABCG2 rs3114018位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性可能與武陵山地區(qū)原發(fā)性痛風(fēng)的發(fā)病相關(guān)，與高尿酸血癥沒有顯著相關(guān)性，提示該位點(diǎn)可能成為恩施地區(qū)人群痛風(fēng)篩查的一個遺傳標(biāo)志。雖然我們發(fā)現(xiàn)rs3114018位點(diǎn)與痛風(fēng)的發(fā)生相關(guān)，但是并不能解釋其在痛風(fēng)中的發(fā)病機(jī)制。另外，考慮到不同種族SNP等位基因頻率不同，以及本研究涉及樣本量相對較少，可能會使結(jié)果存在一定的偏差，需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來完善。