劉海仙 譚 薇 任 橋 李慧芳 李曉彤

(濰坊醫(yī)學院內科教研室,濰坊 261000)

哮喘是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，具有很高的發(fā)病率和死亡率，全球約有3億哮喘患者[1,2]。哮喘是一種慢性氣道炎癥，由多種細胞(如嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組分參與，導致炎性細胞因子增加和氣道可逆性阻塞。細胞凋亡包括線粒體路徑和死亡受體路徑。研究表明在睪丸生精過程中，內源性細胞凋亡途徑可以被激活[3]。文獻表明細胞凋亡在生殖細胞分化、精子成熟和存活中起重要作用[4]。細胞凋亡過程在睪丸中是非常重要的，因為睪丸需要消除有基因缺陷的精子細胞。所以，在精子發(fā)生過程中生殖細胞凋亡的精確控制特別重要，而凋亡途徑的過度激活會降低精子數(shù)量和活性[5]。細胞凋亡相關基因的表達改變多發(fā)生在生育能力低下和精子活性相對較弱的男性中。在重癥哮喘患者中，缺氧導致凋亡途徑的激活已經(jīng)開始引起關注[6]。然而，在睪丸中缺氧反應和細胞凋亡之間的關系研究甚少。哮喘是否會影響男性生育能力仍需進一步研究。本研究把小鼠哮喘動物模型的睪丸作為主要研究對象，擬在了解哮喘和精子生成的潛在關系。并且在基因、蛋白質和酶水平上，對凋亡途徑的激活進行研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物 BALB/c小鼠的處理符合濰坊市人民醫(yī)院倫理委員會(批準號:2014-001)的相關條例，所有實驗都遵循動物實驗的護理和使用指南(NIH publication No.85-23,revised 1985)。6～8周齡的雄性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，所有小鼠都放置在濰坊醫(yī)學院飼養(yǎng)室特定的無菌環(huán)境中。飼養(yǎng)室相對溫度20～25℃，相對濕度50%～70%。在實驗開始之前，先讓小鼠在這種環(huán)境中生活2周以適應環(huán)境。

1.2方法

1.2.1哮喘造模 參照文獻[7]的方法進行造模，即將BALB/c小鼠隨機分為兩組，哮喘組(n=5)和對照組(n=5)。哮喘模型制備時，在第0、14、21天分別予以20 μg OVA+1 mg Al(OH)3+0.1 ml生理鹽水腹腔注射，對照組小鼠則予以0.2 ml生理鹽水腹腔注射。在第28～34天，使用超聲波噴霧器對所有哮喘組小鼠給予OVA(1%,50 min)霧化吸入，而對照組小鼠則給予生理鹽水霧化吸入。在最后一次霧化結束24 h后將所有小鼠處死，并收集睪丸組織以備后續(xù)實驗。

1.2.2組織準備 每只BALB/c小鼠在稱重后予以CO2窒息，取出睪丸后立即稱重并置于液氮中保存，用于后續(xù)PCR和Western blot。

1.2.3精子計數(shù) 參考文獻[8]的方法進行精子計數(shù)及活性的檢測，每只BALB/c小鼠處死后立即收集附睪，置于2 ml的常溫(37℃)PBS中制備混懸液，用滴管吸取20 μl的細胞懸液滴入血細胞計數(shù)板中，放在低倍鏡下觀察并計數(shù)。精子活性通過活動精子占精子總數(shù)的百分比來計數(shù)。

1.2.4病理和免疫組化 將摘除的小鼠睪丸固定在4%的多聚甲醛中制作成石蠟塊，通過HE染色來處理。滴加cleaved-caspase-3抗體(1∶100)孵化，4℃過夜，發(fā)生凋亡的細胞會被染成棕色。

1.2.5RNA提取、PCR芯片和實時熒光定量PCR 將冷凍的睪丸組織在液氮中研磨，并在由the Qiagen RNeasy mini Kit(Applied Biosystems)提供的緩沖液中制備成為混懸液，用以提取RNA。RNA的提取則是依據(jù)試劑盒說明書來進行的。所有的RNA樣本都放置在無RNA酶的RNA試劑盒中，利用RNase-free DNase I來分解剩余的染色體DNA分解為RNA。RNA的濃度和純度用紫外分光光度計分別在波長260 nm和280 nm下測量。

在合成互補DNA前，從每只小鼠樣本中均抽出等量的RNA混勻成哮喘組和對照組兩組，用來進行PCR陣列分析。反轉錄和實時熒光定量PCR均按照試劑盒說明步驟進行。根據(jù)制造商的說明書，使用SYBR Green Real-Time PCR Master Mix(Target Bio)在StepOnePlus Real-time qPCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)中進行PCR陣列分析的實時qPCR。對每個條件測試重復的平板，并進行比較以評估結果的再現(xiàn)性。使用儀器軟件計算每個孔的閾值循環(huán)(Ct)，并且在循環(huán)程序之后立即運行熔解曲線程序。測試所有引物的擴增效率在1.90～2.10之間。 數(shù)據(jù)分析采用ΔΔCt法進行。

基因的差異性表達通過實時熒光定量PCR的方法測定。10只小鼠的睪丸RNA分別逆轉錄為cDNA。HIF-1α、Bax、Bcl-2、BNIP3、AIF、cytochrome c、caspase-9、caspase-3在mRNA水平的表達均通過實時熒光定量PCR的方法測定,如表1。

1.2.6蛋白質提取和Western blot 冷凍的睪丸加入裂解液中，并在液氮中加入蛋白酶抑制劑后研磨制備成混懸液，然后置于冰上裂解10 min。樣本在經(jīng)過徹底離心后獲取蛋白上清液。蛋白質濃度的測定使用蛋白濃度測定試劑盒。為每個蛋白質樣本取出20 mg放入4%～12%Bis-Tris梯度膠進行電泳，然后應用PDVF膜進行轉膜。用10%的脫脂牛奶封閉后，加入抗體孵育。最后，進行壓片和顯影，含有蛋白質條帶的圖像被記錄在底片(柯達)中，并使用 Image J來處理。試驗中所用的一抗應用下述多抗稀釋而來：anti-Bcl-2(1∶500,Santa Cruz Biotech-nology),anti-PARP(1∶1 000,Santa Cruz Biotechn-ology),anti-Bax(1∶500,Santa Cruz Biotechnology),anti-cytochrome c(1∶500,Santa Cruz Biotechnology),anti-HIF-1α(1∶500,Santa Cruz Biotechnology),anti-AIF(1∶1 000,Santa Cruz Biotechnology),anti-GAPDH(1∶20 000,Abcam)和anti-cleaved caspase-3(1∶1 000,Cell Signaling)。

表1用于實時qPCR測定的實時PCR引物

Tab.1Real-timePCRprimersusedinreal-timeqPCRassays

TargetgenePrimersequence(5′?3′)ForwardReverseHIF?1αGCTTACACACAGAAATGGCCAGCACCTTCCACGTTGCTGABaxAGCAAACTGGTGCTCAAGGCCCACAAAGATGGTCACTGTCBcl?2GTGGTGGAGGAACTCTTCAGGTTCCACAAAGGCATCCCAGBNIP3CAGCATGAATCTGGACGAAGATCTTCCTCAGACAGAGTGCAIFTGCTCTTGGCAGAAAGTCTCTTGGGCATCACTTTCACTCCcytochromecGAGGCAAGCATAAGACTGGATACTCCATCAGGGTATCCTCcaspase?9AGTTCCCGGGTGCTGTCTATGCCATGGTCTTTCTGCTCACcaspase?3CCTCAGAGAGACATTCATGGGCAGTAGTCGCCTCTGAAGA

Note:HIF-1α.Hypoxia inducible factor-1α;AIF.Apoptosis-inducing factor.

1.2.7DNA ladder用DNA ladder的方法進行細胞凋亡檢測時按照最近更新的規(guī)定進行[9]。在進行DNA純度和濃度測定后，取出等量的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.8caspase-9和caspase 3/7酶活性的測定 分別使用Caspase-Glo-9和Caspase-Glo-3/7試劑盒(Promega)，操作步驟按照試劑盒說明進行。測定睪丸組織混懸液的蛋白質濃度，并進行蛋白組分析。

2 結果

2.1哮喘組小鼠體重和睪丸重量較對照組小鼠均降低 如表2所示,經(jīng)過7 d的霧化致敏，實驗組小鼠的體重和睪丸絕對重量均較對照組均顯著降低(P<0.05)。同時,哮喘組平均的體重增加明顯低于對照組。

表2對照組和哮喘小鼠體重與絕對睪丸重量的比較

Tab.2Comparisonofbodyweightandabsolutetestisweightbetweencontrolandasthmaticmice

ParametersControlAsthma Initialbodyweight(g)19 540±0 62519 586±0 716 Finalbodyweight(g)31 583±0 46630 328±0 7281) Bodyweightchange(g)12 043±0 56610 642±0 7811) Absolutetestisweight(g)0 1075±0 0050 094±0 0091)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05.

表3對照組和哮喘小鼠之間精子計數(shù)和運動性的比較

Tab.3Comparisonofspermcountandmotilitybetweencontrolandasthmaticmice

ParametersControlAsthmaSpermcounts(×106)6 850±0 9353 980±0 6282)Spermmotility(%)77 482±9 21751 846±12 5481)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05； 2)P<0.01.

2.2哮喘可降低精子數(shù)量和活性 哮喘組的精子數(shù)目及活性均明顯低于對照組(P<0.05，見表3)。值得注意的是,哮喘小鼠的精子計數(shù)為對照組的58.1%，而哮喘組小鼠的睪丸重量僅為對照組的87.4%。

2.3基因、蛋白質和酶水平上的改變

2.3.1哮喘組小鼠睪丸凋亡表達增加 按照標準方法對所有的基因組DNA進行了提純，將每個樣本中取出等量的DNA進行了瓊脂糖凝膠電泳。結果發(fā)現(xiàn)，哮喘組DNA碎片顯著增加(圖1A)。這與Caspase-Glo?檢測試劑盒所得出的結果一致，哮喘組小鼠caspase-3/7酶活性約為對照組的2倍(圖1B)。結果表明哮喘小鼠睪丸中凋亡顯著增加。

2.3.2哮喘小鼠組織病理學改變 組織學檢查發(fā)現(xiàn)對照組小鼠的曲細精管中的生精上皮細胞生成精子過程正常(圖2A)。 而哮喘組小鼠呈現(xiàn)出生精細胞的丟失/亂序/脫落等多種多樣的變化(圖2B)，也觀察到睪丸支持細胞的細胞質中有空泡形成。

2.3.3哮喘誘發(fā)生殖細胞凋亡的激活 用caspase-3單抗進行免疫組化，結果如圖3所示，在哮喘組小鼠的精細胞/精母細胞/睪丸支持細胞/睪丸間質細胞中caspase-3染色顯著增加。

2.3.4改變細胞凋亡相關基因的mRNA水平 采用之前混勻的對照組和哮喘組的樣本，評估涉及程序性細胞凋亡通路或者缺氧信號通路的總共120個關鍵基因的轉錄表達。結果表明OVA致敏的哮喘小鼠的睪丸與對照組小鼠睪丸在7個基因組中表達存在很大差異，包括Bcl-2、Bax、BNIP3、caspase-9、caspase-3、AIF和HIF-1α，如圖4A。對這些靶基因的特異性引物進行實時熒光定量PCR，進一步確定這10只小鼠的睪丸獨自的cDNA樣本的檢測結果。所得的結果與之前對一組缺氧和細胞凋亡相關的基因進行的PCR陣列分析結果一致，如：在患有哮喘的小鼠的睪丸中Bcl-2、抗凋亡因子等等轉錄的表達都顯著減少，然而促凋亡基因(包括Bax、BNIP3、caspase-9和AIF)的mRNA轉錄的表達都顯著增多，哮喘小鼠模型睪丸中的HIF-1α的表達都增多。但是，實時熒光定量PCR的結果顯示兩組中caspase-3的表達差異不大。細胞色素c作為陰性對照，在兩個小組中表達無明顯差異。

圖1 哮喘小鼠睪丸細胞凋亡增強Fig.1 Apoptosis is enhanced in asthmatic mouse testisNote:A.DNA ladder assay was conducted for the 10 testis samples from control and asthma group；B.Quantification of the bands with lower molecular weight (about 150 bp) in Fig.A was done by using Image J software；C.Enzymatic activity of caspase-3/7 was measured for the testis homogenates using Caspase-Glo-3/7 assay kit,and the relative ratio was expressed in the bar graph.Compared with the control group,*.P<0.05;compared with the control group，**.P<0.01.

2.3.5凋亡相關基因的蛋白表達水平 如圖5所示，哮喘小鼠睪丸中抗凋亡基因Bcl-2表達顯著受損，而AIF和HIF-α卻顯著增多，與實時熒光定量PCR得出的結果一致。相反，Bax和細胞色素c的蛋白水平卻不會因為患哮喘而改變(圖5)。符合caspase-3/7酶活性，在哮喘小鼠中，半胱天冬酶-3的切割形式被顯著誘導。提示哮喘小鼠模型中胱天蛋白酶途徑凋亡的激活。

圖2 睪丸組織學變化(HE,×1 000)Fig.2 Histological changes in testis(HE,×1 000)Note:A.Control group;B.Asthma group.

圖3 睪丸免疫組化檢測(×1 000)Fig.3 Immunohistochemisty assay for testis(×1 000)Note:The transverse sections of the testis were stained for cleaved caspase-3.A.Control group;B.Asthma group.

2.3.6哮喘激活小鼠睪丸組織中的caspase-9 結果如圖6A所示，與對照小鼠相比，哮喘睪丸勻漿中caspase-9的總體活性顯著誘導。說明Bcl-2-caspase-9通路在哮喘小鼠睪丸中被激活。通過監(jiān)測細胞凋亡標記物多聚ADP核糖聚合酶(Poly-ADP-ribose polymerase,PARP)來檢查每個睪丸的凋亡水平。與caspase-3的切割增加一致，在哮喘睪丸中，切割的PARP的蛋白水平顯著上調(圖6B、C)。而在哮喘組中，切割的PARP與全長PARP的比例顯著增加(圖6D)。 這些結果與哮喘性睪丸增強的DNA斷裂一致，如DNA梯度測定(圖1A)所示。

與PCR芯片數(shù)據(jù)一致，Bcl-2轉錄的表達在哮喘組小鼠的睪丸中明顯減少，同時促凋亡基因包括Bax、BNIP3、caspase-9和AIF在mRNA水平的表達在哮喘小鼠的睪丸中明顯的增加。HIF-1α的表達在哮喘小鼠模型中的表達顯著增加。但是，實時熒光定量PCR表明在這兩組小鼠中caspase-3的mRNA表達水平無顯著差異?？赡茏鳛橐粋€負反饋調節(jié)，細胞色素C的mRNA表達在哮喘組和對照組小鼠睪丸中并沒有改變。

圖4 凋亡相關基因的mRNA水平Fig.4 Relative mRNA level of several apoptosis-related genesNote:A.Equal amounts of RNA from 5 control or experiment mice were mixed well and split into two groups before cDNA synthesis;B.Equal amounts of RNA samples from the 10 mouse testes were aliquot individually and then subjected to cDNA synthesis respectively.Transcriptional expression of indicated genes was measured by real-time qPCR.Data were presented as with the control group，**.P<0.01.

圖5 凋亡相關蛋白的免疫印跡分析Fig.5 Western blot analysis of apoptosis related proteinsNote:A.Equal amounts of the protein homogenate from the testis tissue were immunoblotted with the indicated antibodies；B.Quantification of the protein expression level in Fig.A was performed using Image J software.Compared with the control group，**.P<0.01.

圖6 哮喘激活蛋白酶caspase-9并增強小鼠睪丸中PARP的切割Fig.6 Asthma activates proteinase caspase-9 and enhan-ces cleavage of PARP in mouse testisNote:A.Enzymatic activity of caspase-9 in the testis homogenates was measured by Caspase-Glo-9 assay kit,and the relative ratio was expressed in the bar graph;B.Western blot analysis of the PARP (full-length and cleaved isoform).The relative level of cleaved PARP was determined using Image J software as demonstrated in the.Fig.C;D.The ratio of cleaved PARP to full-length PARP was shown based on the intensity calculated by Image J software.Data were expressed as with the control group，**.P<0.01.

3 討論

哮喘可能直接影響兒童的身體發(fā)育。這是身體發(fā)育的一個重要決定因素尤其是年輕的危重型患者和沒有適當治療的哮喘患者[10]。然而,哮喘影響身體發(fā)育的確切機制尚未完全闡明?？赡艿脑虬ńM織慢性缺氧、經(jīng)常失眠和疾病本身造成的心理壓力,可能會影響正常的童年發(fā)育[11]。然而,不管是在哮喘兒童還是在哮喘動物模型中，哮喘和男性生殖功能紊亂之間的因果關系知之甚少。本研究通過計數(shù)哮喘小鼠模型精子數(shù)量和活性,發(fā)現(xiàn)哮喘可能干擾動物模型中成熟精子的數(shù)量和活性。進一步研究表明,細胞凋亡在此過程中起著至關重要的作用?；加邢那嗌倌甑木踊钚允欠窀淖兓旧先允俏粗?。本研究結果顯示OVA致敏導致的哮喘對小鼠的身體發(fā)育有很大的影響,包括體重減輕和睪丸重量減少。這些身體發(fā)育的缺陷可能直接影響哮喘小鼠睪丸的成熟精子細胞的數(shù)量。此外,精子能動性和生存能力下降的發(fā)現(xiàn),表明除了身體發(fā)育,也有部分原因可能導致精子發(fā)生下降。通過DNA梯試驗和免疫組織化學方法發(fā)現(xiàn),與對照組相比，OVA誘導的凋亡在哮喘小鼠的睪丸中確實存在。進一步的研究驗證了這一觀點，并且證明了在OVA致敏的老鼠的睪丸中半胱天冬酶細胞凋亡通路被明顯激活。事實上,據(jù)估計,多達75%的精子數(shù)量是由于程序性細胞死亡而丟失[12],而過程的失調可能會導致精子數(shù)量或能動性明顯減少,從而導致男性不育。許多外在環(huán)境壓力可能會導致睪丸細胞凋亡通路過度激活,包括高溫、缺氧和一系列的化學危險品[13]。通過對HIF-1α表達式的歸納推理表明，在患有哮喘的情況下,缺氧可能是睪丸細胞凋亡升高的主要原因之一。此外,既往研究表明,精子的發(fā)生可能受許多其他因素的影響,如激素水平[14]。因此,除了細胞凋亡，生物學途徑可能在OVA致敏的哮喘小鼠的精子的成熟和活性中發(fā)揮作用。為了闡明這一假說,在哮喘小鼠中應用細胞凋亡蛋白酶抑制劑來檢測精子產(chǎn)生能否升至正常水平。之前已經(jīng)證實,HIF-1α在哮喘小鼠模型的肺中及哮喘患者的肺泡灌洗液中表達增加,在這里,我們發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達也顯著誘導哮喘睪丸mRNA水平和蛋白水平[15]。作為缺氧反應的關鍵調節(jié)器,HIF-1α蛋白表達可以誘導多種組織缺氧,形成異二聚體的轉錄因子HIF-1和HIF-1β[16]。反過來,HIF-1可以通過誘導高濃度的pro-apoptotic蛋白質,如BNIP3來啟動細胞凋亡[17]。BNIP3的表達在哮喘睪丸PCR數(shù)組中得到證實。然而,據(jù)報道,抗凋亡蛋白,如IAP-2,也可能是在缺氧時產(chǎn)生,從而抵消了細胞凋亡過程。因此在誘導和阻止細胞凋亡的多種誘發(fā)因素之間可能存在一個錯綜復雜的平衡。除了BNIP3,促凋亡因素Bax、AIF和caspase-9的表達也相應增加,同時，在目前的研究中發(fā)現(xiàn)抗凋亡因子bcl-2的水平下降。與上述一致,這些蛋白質誘導哮喘睪丸進行細胞凋亡,而不是存活。然而,哮喘睪丸中 Bax、AIF和caspase-9誘發(fā)的上游通路以及bcl-2的抑制仍有待明確。作為細胞凋亡的下游事件,本研究檢測了caspase-9 caspase-3/7,連同caspase-3和PARP的活性。這些結果說明與對照組相比，哮喘小鼠的細胞凋亡酶導致的細胞凋亡通路被顯著激活,這可能是睪丸精子的生存能力和活性降低的原因。先前有報道稱,細胞凋亡不完全是由細胞凋亡蛋白酶介導。其中,凋亡誘導因子(AIF)是第一個被發(fā)現(xiàn)不受細胞凋亡蛋白酶約束的足以誘導細胞死亡的細胞死亡效應器。AIF和細胞色素c可能從線粒體膜間隙流出，改變了細胞核的位置，這個位置可能通過核酸內切酶促進DNA片段化。有趣的是,PCR芯片發(fā)現(xiàn)凋亡誘導因子的轉錄水平有所提高,并且Western blot證實在哮喘小鼠睪丸中蛋白表達增加[18]。因此,細胞凋亡蛋白酶和不依賴細胞凋亡蛋白酶的細胞死亡效應蛋白器如AIF共同合作來誘導哮喘小鼠細胞凋亡。結合對Bcl-2/Bax的觀察,這些結果共同表明,哮喘可能導致細胞凋亡的線粒體途徑的激活。免疫組織化學顯示的,大部分精原細胞和精母細胞發(fā)生凋亡,而只有小部分體細胞如支持細胞和睪丸間質細胞發(fā)生凋亡。因此哮喘小鼠睪丸的體細胞中的信使RNA和蛋白質水平可能會增加，這種增加可以直接改變整個caspase-9、caspase-3/7酶活性[19]。此外,某些細胞的丟失會使這些細胞產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的相對水平改變[20]。在這種情況下,精子形成障礙可能導致一個簡單的非生殖細胞的mRNA的表達增加。因此,很難區(qū)分哮喘組與對照組中發(fā)生細胞凋亡的睪丸中一個信使RNA或一種蛋白質的表達水平。