尚永輝，孫家娟，周 琴，毛 茹，商 娟

（咸陽師范學院 化學與化工學院，咸陽712000）

槲皮素又稱槲皮黃素或櫪精，屬黃酮類有機化合物，廣泛存在于蔬菜、水果以及谷類植物中，具有祛痰、止咳、平喘，降血脂、擴張冠狀動脈和增加冠脈血流量等多種功效［1］。近年的研究發(fā)現(xiàn)：其在抗人類免疫缺陷病毒（HIV）以及抗癌等方面也具有一定的潛在藥理作用，特別在前列腺癌的治療方面效果顯著［2］。

脫氧核糖核酸（DNA）是生物界遺傳信息的數(shù)據(jù)庫，生物的發(fā)育和生命的基體機能正常運轉是通過DNA來指導的，同時DNA也是組成遺傳命令的主體［3］。DNA是由很多組分組成的一條長鏈聚合物，藥物分子和DNA作用之后會改變DNA長鏈的序列，從而在一定程度上改變了DNA的性質。DNA是抗癌藥物分子在人體內作用的靶標物，近年來，藥物分子與DNA作用的研究十分廣泛。

本工作探究了槲皮素在多壁碳納米管修飾碳糊電極上的電化學行為，并研究了槲皮素與DNA的相互作用。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

CHI 660C型電化學工作站；CH 2250型電子天平；DZX－3型真空干燥箱；KQ 520DE型數(shù)控超聲波清洗器；三電極系統(tǒng)：多壁碳納米管修飾碳糊電極為工作電極，Hg／Hg2Cl2為參比電極，鉑電極為輔助電極。

槲皮素標準儲備溶液：1．00×10－3mol·L－1，稱取槲皮素0．015 1g，用熱乙醇溶解后轉移至50mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻，備用。

DNA 溶 液：604mg· L－1，稱 取 DNA 0．030 2g，用水在50mL燒杯里攪拌至完全溶解，再轉移至50mL容量瓶中，用水定容，搖勻，備用。

中性紅溶液：1．00×10－3mol·L－1，稱取中性紅粉末0．014 4g，用水溶解，轉移至50mL容量瓶中，用水定容，搖勻，備用。

試驗用水為蒸餾水。

1．2 試驗方法

1．2．1 電極的制備

取石墨粉適量于研缽中，逐滴加入液體石蠟適量并充分研磨至混合物呈有韌性的小片狀，夯實填充入0．5mL注射器中。將打磨后的銅絲從尾端插入作為電極的導線，另一端打磨拋光至鏡面，制得裸碳糊電極。

稱取多壁碳納米管粉末5mg于試管中，加入二甲基甲酰胺（DMF）適量，用數(shù)控超聲波超聲分散2h，使其均勻分散，制得多壁碳納米管DMF懸浮液。移取上述懸浮液10μL，滴至制備好的裸碳糊電極表面，倒立放置，自然晾干，制得多壁碳納米管修飾碳糊電極。

1．2．2 電化學測定

移取 pH 3．29 的 B－R 緩沖溶液 3．00mL 于10mL比色管中，加入槲皮素標準儲備溶液適量，用水定容至10mL，搖勻，以多壁碳納米管修飾碳糊電極為工作電極，用三電極系統(tǒng)測定循環(huán)伏安曲線和差分脈沖曲線。

2 結果與討論

2．1 槲皮素的電化學特性

移取槲皮素標準溶液適量，分別用裸碳糊電極和多壁碳納米管修飾碳糊電極作為工作電極，按試驗方法進行循環(huán)伏安掃描，掃描速率為0．30V·s－1，結果見圖1。

圖1 不同電極的循環(huán)伏安圖Fig．1 CVs of different electrodes

由圖1可知：槲皮素在裸碳糊電極上產生一個較為明顯的氧化峰，無明顯還原峰出現(xiàn)；槲皮素在多壁碳納米管修飾碳糊電極上產生一對明顯的氧化還原峰，峰電位分別為0．488，0．348V，且氧化峰的電流信號明顯強于裸碳糊電極上的氧化峰電流信號（約為裸碳糊電極上電流信號的5．3倍），這表明多壁碳納米管對槲皮素有很好的催化作用。

2．2 試驗條件的選擇

2．2．1 酸 度

試驗考察了酸度對槲皮素電化學信號的影響。槲皮素在不同pH的B－R緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖見圖2，槲皮素標準溶液的濃度為2．00×10－4mol·L－1，掃描速率為0．30V·s－1。

圖2 槲皮素在不同pH的B－R緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖Fig．2 CVs of quercetin in B－R buffer solution with different pH

由圖2可知：隨著pH增加，槲皮素的氧化峰線性負移，峰電位（Ep）與pH的線性回歸方程為Ep＝－0．066 42pH＋0．747 4，相關系數(shù)為0．996 6，表明有質子參與槲皮素在多壁碳納米管修飾碳糊電極上的反應過程，依據(jù)峰電位與pH之間的公式：

式中：m為質子轉移數(shù)；E0為標準電極電位；n為電子轉移數(shù)。計算得m／n＝1．122≈1，即m＝n，表明該電極反應為等質子等電子參與過程［4］。

pH為3．29時，槲皮素氧化峰電流最大，峰形最佳，試驗選擇反應體系的pH為3．29。

2．2．2 底液

試驗考察了槲皮素分別在pH為3．29的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖溶液、B－R緩沖溶液、鄰苯二甲酸氫鉀－鹽酸、乙酸－乙酸鈉、磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液等5種底液中的電化學信號，槲皮素標準溶液的濃度為2．00×10－4mol·L－1，掃描速率為0．30V·s－1，底液對電化學性質的影響見圖3。

圖3 底液對電化學性質的影響Fig．3 Effect of based liquid on electrochemical properties

由圖3可知：槲皮素在pH 3．29的B－R緩沖溶液中氧化峰電流最大，峰形最好。試驗選擇pH為3．29的B－R緩沖溶液為底液。

2．2．3 掃描速率

移取1．00×10－3mol·L－1槲皮素標準儲備溶液2．00mL于pH 3．29的B－R緩沖溶液中，用多壁碳納米管修飾碳糊電極為工作電極，在最佳電位下改變掃描速率，記錄循環(huán)伏安曲線，掃描速率對電化學性質的影響見圖4。

由圖4可知：隨掃描速率增加，槲皮素的氧化峰電流逐漸增加，峰電位逐漸正移。試驗選擇掃描速率為0．30V·s－1。

圖4 掃描速率對電化學性質的影響Fig．4 Effect of scanning rates on electrochemical properties

試驗還發(fā)現(xiàn)，0．488V左右的氧化峰電流與其對應的掃描速率呈線性關系，線性回歸方程為I＝－18．81 v－3．903，相關系數(shù)為0．997 0。這表明槲皮素在修飾電極表面的電極反應受吸附控制。

氧化峰電位對掃描速率的線性回歸方程為Ep＝0．022 3lnv＋0．478 6，相關系數(shù)為0．996 5。根據(jù)公式（2）：

式中：α為電子轉移系數(shù)；k為電極反應速率常數(shù)；F為法拉第常數(shù)；Eθp為標準峰電位；R為摩爾氣體常數(shù)；T 為熱力學溫度。α取0．5［5］，得到n＝2．30≈2，結合2．2．1節(jié)電極反應為等質子等電子參與過程，可知槲皮素在多壁碳納米管修飾碳糊電極上的電化學反應過程為2質子2電子參與轉移的過程，槲皮素在多壁碳納米管修飾碳糊電極上的電極反應過程見圖5。

圖5 電極反應過程Fig．5 Process of electrode reaction

根據(jù)文獻［6］可知：在循環(huán)伏安曲線上觀察到槲皮素在約0．88V和約0．20V處的較小的峰電流（Ip）可能是槲皮素結構式中C3位上的－OH反應引起的。

2．3 標準曲線及檢出限

按試驗方法測定了槲皮素標準溶液系列的差分脈沖曲線，結果表明：槲皮素的濃度在5．00×10－7～5．00×10－5mol·L－1內與其對應的差分脈沖伏安電流呈線性關系，線性回歸方程為－i＝8 472 c＋8．720，相關系數(shù)為0．999 7，檢出限為2．00×10－7mol·L－1。

2．4 槲皮素與DNA的相互作用

2．4．1 槲皮素與DNA相互作用的電化學方法

移取pH 3．29的 B－R 緩沖溶液2．00mL于比色管中，加入一定量的1．00×10－3mol·L－1槲皮素標準儲備溶液和一定量的DNA溶液，用水定容至10mL，搖勻，靜置60min，使其充分反應。以多壁碳納米管修飾電極為工作電極的三電極系統(tǒng)進行測定，記錄循環(huán)伏安曲線和差分脈沖曲線，DNA對槲皮素電化學行為的影響見圖6。

圖6 DNA對槲皮素電化學行為的影響Fig．6 Effect of DNA on electrochemical behavior of quercetin

由圖6（a）可知：隨著DNA質量濃度的增加，槲皮素的氧化峰、還原峰電流均依次減小，其中氧化峰逐漸正移，還原峰逐漸負移，氧化峰正移程度大于還原峰負移程度，表明隨著DNA的加入，槲皮素峰電位明顯正移。根據(jù)文獻［7］總結的相互作用規(guī)律，推測槲皮素主要通過嵌入方式與DNA產生相互作用。圖6（b）也觀察到一致的現(xiàn)象：隨著DNA的加入，峰電流減小了21．1%（曲線1～5），峰電位正移了13mV（曲線1的0．410V到曲線5的0．423V）。從結構上看：槲皮素的主體結構有5個羥基，屬親水基團，易與DNA上的堿基對發(fā)生相互作用。

2．4．2 以中性紅為探針研究槲皮素與DNA的相互作用

中性紅能與DNA發(fā)生嵌插作用［8］。為了進一步探究槲皮素與DNA的相互作用過程，試驗以中性紅為探針進行研究。在pH 3．29的B－R緩沖溶液中，分別加入一定量的中性紅溶液，中性紅與DNA的混合溶液，中性紅、DNA和槲皮素的混合溶液，分別靜置反應30min后，按試驗方法以多壁碳納米管修飾碳糊電極為工作電極測定差分脈沖曲線和紫外－可見吸收光譜。中性紅、DNA及槲皮素反應的差分脈沖曲線和紫外－可見吸收光譜見圖7。

圖7 中性紅、DNA及槲皮素反應的差分脈沖曲線和紫外－可見吸收光譜Fig．7 DPVs and UV－Vis adsorption spectra of neutral red，DNA dn quercetin

由圖7（a）可知：中性紅在－0．268V處具有一靈敏的氧化峰（曲線1）；加入DNA后，由于中性紅與DNA的結合導致體系中中性紅的濃度降低，從而使中性紅氧化峰電流隨之降低（曲線2）；當體系中加入槲皮素后，中性紅的峰電流又明顯增強（曲線3）。圖7（b）也得到了相同的試驗結果。這應該是由于槲皮素、中性紅兩者與DNA的相互作用過程具有相同的作用方式和作用位點?；旌先芤褐虚纹に嘏c中性紅相互競爭與DNA相結合，加入的槲皮素通過競爭導致插進DNA雙鏈的堿基對中的中性紅分子被游離出來，因此體系中游離的中性紅濃度增加，導致中性紅的氧化峰電流和吸光度增加。據(jù)此可以判斷槲皮素與中性紅類似能有效插進DNA雙鏈的堿基對中，與DNA發(fā)生嵌插作用的結合。

本方法靈敏度高、檢出限低，可作為槲皮素測定的新方法。

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