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(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

我國(guó)是一個(gè)地域遼闊的多民族國(guó)家,擁有眾多具有獨(dú)特民族特色的傳統(tǒng)食品。傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品作為這類食品的典型代表,其主要由微生物自然發(fā)酵各種動(dòng)物乳而獲得,產(chǎn)品的主要發(fā)酵為乳酸[1]。我國(guó)部分地區(qū)居民早在2000多年前就有制作和食用發(fā)酵乳制品的習(xí)俗,加之不同的氣候環(huán)境、地理因素以及制作工藝的差異,使得傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中蘊(yùn)藏的微生物多樣性極為豐富[2-3]。這些微生物對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的風(fēng)味、組織質(zhì)地、穩(wěn)定性等方面有很重要的影響[4-5]。

454焦磷酸測(cè)序因其具有效率高、通量高、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn),被廣泛用于微生物多樣性的研究。之前也有一些基于該技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)自然發(fā)酵乳制品如酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶中細(xì)菌多樣性的研究報(bào)道,但這些研究大多集中于探究傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的生物多樣性[6-8],而對(duì)傳統(tǒng)乳制品真菌多樣性的研究相對(duì)較少。此外,這些研究大多僅停留在微生物多樣性的揭示,缺乏對(duì)核心菌群及其相關(guān)關(guān)系的深入探究。全面分析傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的生物多樣性、共有菌群以及共有菌群間相關(guān)關(guān)系,對(duì)于掌握傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生及變化規(guī)律、優(yōu)化這類產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝、實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化生產(chǎn)以及科學(xué)地篩選開發(fā)具有優(yōu)良品質(zhì)的工業(yè)發(fā)酵劑具有重要意義。

本研究基于上述背景,通過(guò)454焦磷酸測(cè)序技術(shù)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)采集自我國(guó)新疆地區(qū)的酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶三份樣品中微生物多樣性、豐度、核心菌群以及核心菌群之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析。以期了解傳統(tǒng)不同地區(qū)和不同類型發(fā)酵乳制品中的微生物多樣性,為標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化生產(chǎn)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品提供數(shù)據(jù)支持,同時(shí)對(duì)于開發(fā)適合不同發(fā)酵乳制品的工業(yè)發(fā)酵劑提供有意參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

樣品 本研究從新疆自治區(qū)特克斯鎮(zhèn)一大隊(duì)局馬洪(奇勒烏澤克鄉(xiāng))牧民家中,分別采集了牧民使用傳統(tǒng)發(fā)酵手段制備的酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶樣品各一份。將樣品放置于有冰袋的冷藏箱內(nèi)迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,并置于-80 ℃冰箱冷藏備用。

5810R型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;GDS-8000型凝膠成像儀 美國(guó)UVP公司;DYY-12型電泳儀 北京六一公司;PTC-200型梯度PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)伯樂公司;2100型生物分析儀 美國(guó)安捷倫公司;RocheGSFLX型測(cè)序儀 美國(guó)Roche454公司;ND-2000C微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Nano Drop公司;OMEGA DNA isolation kit(D5625-01)試劑盒 美國(guó)OMEGA公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品DNA提取及PCR擴(kuò)增 使用OMEGA DNA isolation kit(D5625-01)試劑盒提取微生物宏基因組,完整度(瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果在500 bp處有單一明亮條帶)、純度(OD260/OD280在1.8～2.0之間)及濃度(在10～20 μg之間)均滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求的DNA樣品暫存到-20 ℃冰箱備用。

PCR擴(kuò)增體系:10×PCR緩沖液2.5 μL,10 mmol/L dNTPs mix 2 μL,正向引物1 μL,反向引物1 μL,5 U/μL DNA聚合酶0.3 μL,模板DNA 1 μL,體系用去離子水補(bǔ)充至25 μL。

細(xì)菌16S rRNA V1-V3區(qū)正向引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′),其反向引物為533R(5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′)。真菌18S rRNA正向引物3NDF(5′-GGCAAGT CTGGTGCCAG-3′);其反向引物為(5′-ACGGTATCT(AG)ATC(AG)TCTTCG-3′)且在正向引物中加入7個(gè)核苷酸標(biāo)簽(barcode)。

擴(kuò)增條件為:首先94 ℃預(yù)變性5 min,然后94 ℃變性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min后重復(fù)30個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)合格后,PCR產(chǎn)物置-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 454焦磷酸測(cè)序 通過(guò)產(chǎn)物純化、安捷倫2100生物分析儀定量混勻,上樣測(cè)序。焦磷酸測(cè)序按照 454 Roche GS-FLX的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行測(cè)試。

1.2.3 序列優(yōu)化及質(zhì)控 454測(cè)序得到的數(shù)據(jù)確認(rèn)引物位置后,認(rèn)為兩端引物之間的片段為可變區(qū),篩選可變區(qū)長(zhǎng)度大于300 bp的序列。根據(jù)樣本barcode編號(hào)進(jìn)行篩選,必須為首7位且不允許錯(cuò)配?？刂普麠l序列上質(zhì)量得分大于20的堿基所占比例高于93%。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 通過(guò)QIIME(v1.7.0)分析平臺(tái)對(duì)進(jìn)行過(guò)質(zhì)量控制的序列進(jìn)行物種豐度和多樣性分析,主要的操作步驟如下:

通過(guò)PyNAST對(duì)序列進(jìn)行校準(zhǔn)排齊,在序列100%相似性下進(jìn)行UCLUST歸并,建立無(wú)重復(fù)的16S rRNA序列集;

在給定相似度97%水平上進(jìn)行分類操作單元(Operational taxonomic units,OTU)劃分;

通過(guò)ChimeraSlayer檢測(cè)屬于嵌合體的OTU,隨后去除;

將OTU代表性序列通過(guò)RDP(Ribosomal Database Project,Release 11.5)和Greengenes(Release 13.8)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì),整合兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果,確定每個(gè)OTU最終的分類學(xué)地位;

使用FastTree軟件繪制基于OTU代表性序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,并計(jì)算樣品的α和β多樣性。

1.2.5 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中核心細(xì)菌和真菌的豐富度指標(biāo)、多樣性指標(biāo)和基于屬分類地位的細(xì)菌和真菌相對(duì)含量進(jìn)行相關(guān)性分析。通過(guò)Origin 8.5軟件和R軟件(v3.3.2)對(duì)QIIME產(chǎn)生的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)可視化處理。

1.2.6 核酸登錄號(hào) 本研究中所有序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫(kù),項(xiàng)目ID號(hào)為mgp79277。

2 結(jié)果與分析

2.1樣品中細(xì)菌分析

2.1.1 細(xì)菌的豐度和多樣性分析 通過(guò)454焦磷酸高通量測(cè)序,分別獲得7367條、15303條和11748條酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶樣品高質(zhì)量細(xì)菌序列。三份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品樣品細(xì)菌的稀疏曲線(圖1A)和香農(nóng)指數(shù)曲線(圖1B)如圖1所示。由圖1A可知,隨著測(cè)序深度的增加發(fā)現(xiàn)物種的數(shù)量也隨之增加,但與此同時(shí)每個(gè)樣品的shannon曲線已進(jìn)入平臺(tái)期。由此可知,雖然隨著測(cè)序量的增加有可能會(huì)發(fā)現(xiàn)新的細(xì)菌種系型,但樣品細(xì)菌的多樣性已經(jīng)不再隨測(cè)序量的增加而發(fā)生變化。因此本研究細(xì)菌測(cè)序量滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析的要求。

圖1 3份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品樣品中細(xì)菌的稀疏曲線(A)和香農(nóng)指數(shù)(B)Fig.1 Rarefaction analysis(A)and shannon diversity(B) estimates in bacteria from three traditional fermented dairy products samples

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶樣品分別得到了86個(gè)、24個(gè)和134個(gè)細(xì)菌OTUs。與此同時(shí),三份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品樣品的chao1指數(shù)分別為136.18、31.94和208.82,simpson指數(shù)分別為0.62、0.32和0.82,shannon指數(shù)分別為2.37、0.77和3.51。上述結(jié)果表明,在微生物豐度和多樣性方面酸駝奶高于酸牛奶和酸馬奶、酸馬奶高于酸牛奶。造成該結(jié)果的原因可能是三種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品原料中蛋白質(zhì)、VA、Fe、Ca、VB2含量在鮮駝奶、鮮牛奶和鮮馬奶中依次降低[9],其原料乳營(yíng)養(yǎng)成分的不同可能導(dǎo)致了菌群多樣性和豐度的不同。

2.1.2 細(xì)菌OTU水平上三份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品樣品菌群分析 為了研究三份不同傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中細(xì)菌菌群的共性和差異,本研究在OTU水平上繪制了3份樣品細(xì)菌OTUs的Venn(維恩)圖,如圖2所示。三份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中,共有的OTUs為6個(gè),包含24777條序列,占全部序列(共計(jì)34688條序列)的71.4%。酸牛奶與酸駝奶樣品共享26個(gè)OTUs,其中包含28110條序列,占全部序列的81.0%。酸馬奶樣品與酸駝奶樣品共享14個(gè)OTUs,其中包含25084條序列,占全部序列的72.3%。酸牛奶樣品、酸馬奶樣品與酸駝奶樣品,分別擁有59個(gè)、9個(gè)和99個(gè)獨(dú)有OTUs,分別包含5143、16和1112條獨(dú)有序列,分別占全部序列(共計(jì)34688條序列)的14.8%、0.05%、3.2%。上述結(jié)果顯示,三份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品共有的OTU個(gè)數(shù)雖然少,但是擁有大量的序列數(shù)。該結(jié)果表明,在三份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中存在一部分具有大量序列的共有OTUs。

圖2 基于OTU水平對(duì)三種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品菌群分析Fig.2 Based on OTU levels of three types of traditional fermented dairy products bacteria flora analysis

2.1.3 樣品中細(xì)菌相對(duì)含量的比較分析 對(duì)樣品中的細(xì)菌相對(duì)含量進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)酸牛奶中細(xì)菌分別由Firmicutes(89.79%)、Proteobacteria(9.22%)、Bacteroidetes(0.55%)、Actinobacteria(0.39%)和Deinococcus-Thermus(0.05%)5個(gè)菌門組成。酸馬奶中細(xì)菌分屬Firmicutes(99.98%)、Proteobacteria(0.01%)和Bacteroidetes(0.01%)3個(gè)菌門。酸駝奶中細(xì)菌分別由Firmicutes(82.94%)、Proteobacteria(16.73%)、Bacteroidetes(0.19%)、Actinobacteria(0.12%)、Acidobacteri(0.01%)和Fusobacteria(0.01%)組成。由圖3可知,三份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品均主要以Firmicutes為主。

圖3 3份傳統(tǒng)乳制品樣品中的細(xì)菌組成Fig.3 Compositions of bacteria in three traditional dairy products

如圖3 所示,在屬水平上酸牛奶樣品中的細(xì)菌主要由Lactococcus、Leuconostoc、Kluyvera、Lactobacillus和Weissella組成,其相對(duì)含量分別為66.78%、15.19%、8.34%、4.84%和1.90%。酸馬奶樣品中的細(xì)菌以Lactobacillus為主,其相對(duì)含量為99.93%。酸駝奶樣品中大于1%的細(xì)菌屬有Lactobacillus、Lactococcus、Leuconostoc、Acetobacter、Streptococcus、Citrobacter、Pseudomonas和Shigella,其相對(duì)含量分別為53.72%、18.72%、6.44%、6.09%、3.94%、3.72%、2.38%和1.51%。由此可見,Lactobacillus是酸馬奶和酸駝奶中的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬,發(fā)酵酸牛奶中Lactococcus為主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。值得一提的是,本研究還從酸馬奶樣品中檢測(cè)到有害菌屬——志賀菌屬。該菌屬的存在可能與自然發(fā)酵的開放狀態(tài)和傳統(tǒng)制作工藝的粗放操作有關(guān),預(yù)示著傳統(tǒng)家庭作坊式的乳制品制作工藝可能存在的潛在安全問題。但由于本研究樣本數(shù)較少,有害菌屬的來(lái)源仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

Oki 等以焦磷酸測(cè)序技術(shù),對(duì)蒙古國(guó)6個(gè)地區(qū)的53份傳統(tǒng)發(fā)酵乳中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析,得到3 個(gè)門21 個(gè)細(xì)菌屬,其中屬Lactobacillus為優(yōu)勢(shì)菌屬[10]。Xu等和Liu等采用同樣的技術(shù)分別對(duì)中國(guó)新疆和中國(guó)西藏地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌多樣性進(jìn)行了分析,其結(jié)果均顯示Firmicutes為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門Lactobacillus為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬[11-12]。而包秋華等以純培養(yǎng)和DGGE技術(shù)對(duì)四川發(fā)酵酸牦牛奶制品曲拉進(jìn)行乳酸菌多樣性分析,研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬[13]。呼斯楞等以純培養(yǎng)和16S rRNA基因序列分析法對(duì)內(nèi)蒙古呼倫貝爾地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中的乳酸菌進(jìn)行多樣性分析,得到Lactococcuslactissubsp.lactis為內(nèi)蒙古呼倫貝爾地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的優(yōu)勢(shì)菌種占總分離株的25%,其次為L(zhǎng)actobacillusparacasei,占總分離株的20.83%[14]。

以上結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近,均表明在傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中存在豐富的細(xì)菌多樣性。牛奶、馬奶和駝奶的營(yíng)養(yǎng)成分存在差異,不同營(yíng)養(yǎng)成分導(dǎo)可能致了乳制品中菌群結(jié)構(gòu)存在差異[15]。在三份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中,酸駝奶樣品的微生物菌群組成相較于其余兩種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品樣品的微生物群落更加復(fù)雜。而酸馬奶的微生物菌群組成在三份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中相對(duì)簡(jiǎn)單。

2.2樣品中真菌分析

2.2.1 真菌豐度和多樣性分析 酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶樣品經(jīng)過(guò)測(cè)序后分別得到4375條、7599條和5360條高質(zhì)量真菌序列,經(jīng)過(guò)OTU劃歸后分別得到了41個(gè)、21個(gè)和11個(gè)OTUs。三份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品樣品真菌的chao1 指數(shù)分別為26.59、11.09和49.94,simpson指數(shù)分別為0.48、0.28和0.75,shannon指數(shù)分別為1.31、0.95和2.65。樣品的真菌的稀疏曲線和香農(nóng)指數(shù)如圖4所示。其結(jié)果與細(xì)菌結(jié)果相似,隨著測(cè)序測(cè)序深度的增加本研究將獲得真菌的物種數(shù)量也隨之增加,但與此同時(shí)每個(gè)樣品的shannon曲線已進(jìn)入平臺(tái)期。雖然隨著測(cè)序量的增加新的真菌種系將從樣品中被發(fā)現(xiàn),但樣品真菌的多樣性已經(jīng)不再隨測(cè)序量的增加而發(fā)生變化。因此本研究的真菌的測(cè)序量亦滿足后續(xù)的生物信息學(xué)分析要求。

圖4 3份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品樣品中真菌的香農(nóng)指數(shù)圖(A)和稀疏曲線(B)Fig.4 Shannon diversity estimates(B)and rarefaction analysis(A) in fungi from three traditional fermented dairy products samples

2.2.2 基于OTU水平對(duì)三份傳統(tǒng)乳制品樣品菌群分析 為了研究三種不同傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中證明菌群的共性和差異,本研究在OTU水平上繪制了三份樣品真菌OTU水平的Venn圖,其結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯鋈輼悠钒?44個(gè)OTUs,其中包含17334條序列。其中,三份樣品共有的OTU為5個(gè),其中包含13936條序列,占全部序列的80.4%。酸牛奶樣品與酸馬奶樣品共享7個(gè)OTUs,其中包含16028條序列,占全部序列的92.5%。酸牛奶樣品與酸駝奶樣品共享9個(gè)OTUs,其中包含14210條序列,占全部序列的82.0%。酸馬奶樣品與酸駝奶樣品共享6個(gè)OTUs,其中包含14065條序列,占全部序列的81.1%。酸牛奶樣品、酸馬奶樣品與酸駝奶樣品,分別擁有30、12和1個(gè)獨(dú)有OTU,分別包含480、405和18條獨(dú)有序列,分別占樣品全部序列的2.8%、2.3%、0.1%。其結(jié)果與細(xì)菌OTU水平Venn圖結(jié)果相似,三份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中共有的OTUs雖然數(shù)目較少,但包含整個(gè)序列中大部分的序列。而這部分共有的OTU可能是傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中核心菌群。

圖5 基于OTU水平對(duì)三種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品菌群分析Fig.5 Based on OTU levels of three types of traditional fermented dairy products

2.2.3 樣品中真菌含量的比較分析 傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中真菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)明顯低于細(xì)菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)。酸牛奶樣品和酸駝奶樣品中均包含Ascomycota和Basidiomycota2個(gè)真菌門,其相對(duì)含量分別為98.83%、0.11%和99.98%、0.02%。酸馬奶樣品只含有Ascomycota。由此可知Ascomycota為三份傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品的優(yōu)勢(shì)真菌菌門。據(jù)報(bào)道,Ascomycota也是韓國(guó)酒精飲料(Korean alcoholic beverages)、可可豆(Coco bean)、發(fā)酵白酒(Chinese liquor)的優(yōu)勢(shì)菌門,于此同時(shí)Ascomycota是真菌界中種類最多的一個(gè)門[16-17]。

如圖6 所示,從酸牛奶樣品中共發(fā)現(xiàn)17 個(gè)真菌屬,其中優(yōu)勢(shì)真菌屬分別為Galactomyces、Gibberella、Vanderwaltozyma、Wickerhamomyce、Dipodascus,其含量分別為39.36%、37.10%、8.59%、6.33%、5.17%、1.28%和1.23%。酸馬奶樣品中共發(fā)現(xiàn)6個(gè)真菌屬,其中優(yōu)勢(shì)真菌屬分別為Vanderwaltozyma和Dipodascus,其相對(duì)含量分別為69.43%和30.00%。酸駝奶樣品中共發(fā)現(xiàn)7個(gè)真菌屬,其中優(yōu)勢(shì)真菌屬分別為耐堿酵母屬Galactomyces、Vanderwaltozyma、Gibberella,其相對(duì)含量分別為84.57%、9.24%和2.72%。Galactomyces是酸牛奶和酸駝奶樣品的優(yōu)勢(shì)真菌屬,酸馬奶的優(yōu)勢(shì)真菌屬為Vanderwaltozyma。

圖6 3份傳統(tǒng)乳制品樣品中的真菌組成Fig.6 Compositions of fungus in threetraditional fermented dairy products

孫志宏等以焦磷酸測(cè)序技術(shù),對(duì)西藏牦牛奶樣品進(jìn)行生物多樣性分析,其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Galactomyces為優(yōu)勢(shì)菌屬[18]。烏仁圖雅以同樣的方法對(duì)內(nèi)蒙古多部地區(qū)的酸牦牛奶的生物多樣性進(jìn)行了分析,其中優(yōu)勢(shì)真菌門為Ascomycota、優(yōu)勢(shì)真菌屬為Galactomyces[19]。而張冬蕾以焦磷酸測(cè)序技術(shù),對(duì)新疆22份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品進(jìn)行生物多樣性分析,結(jié)果顯示其優(yōu)勢(shì)菌門為Ascomycota、優(yōu)勢(shì)真菌屬為Saccharomyces[20]。上述結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,其均證明不同發(fā)酵類型的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品菌群構(gòu)成存在一定的差異。其結(jié)果可能是導(dǎo)致傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品口感豐富的原因之一。

2.3共有菌群中細(xì)菌與真菌相關(guān)關(guān)系

圖2和圖5的結(jié)果表明,三份傳統(tǒng)發(fā)酵樣品共享的OTU數(shù)目雖少,但包含的序列數(shù)卻很多,這部分OTU所代表的微生物類群有可能是傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品的“核心微生物群”。此外,每份樣品還有一定數(shù)量獨(dú)有的OTU,但這部分OTU包含的序列數(shù)相對(duì)較少。這進(jìn)一步說(shuō)明,傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中主要優(yōu)勢(shì)菌種始終存在,而由于發(fā)酵乳原料不同以及加工手段不同會(huì)使得一些低豐度的物種存在一定差異。

為探究三份發(fā)酵乳中核心發(fā)酵菌群中細(xì)菌與真菌的相關(guān)關(guān)系,本研究從三份樣品中均含有的菌群出發(fā),根據(jù)菌群相對(duì)含量利用R軟件計(jì)算其相關(guān)性,結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示,Lactococcus與Galactomyces、Lactococcus與Leuconostoc的相對(duì)含量存在顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05),而Leuconostoc與Galactomyces、Gibberella與Prevotella的相對(duì)含量存在顯著正相關(guān)(p<0.05)。

據(jù)報(bào)道在發(fā)酵乳制品中,Leuconostoc與真菌或細(xì)菌真菌共生體共同參與發(fā)酵乳制品的發(fā)酵過(guò)程[21]。因此在三份乳制品中,Leuconostoc與Galactomyces可能存在互利共生關(guān)系,導(dǎo)致其相對(duì)含量存在顯著正相關(guān)。而酵母菌據(jù)報(bào)道在促進(jìn)微生物的共生作用、CO2的形成、提高特殊風(fēng)味和香氣起著重要作用[22]。據(jù)報(bào)道,酵母菌可以分泌脂肪酶,分解脂肪形成游離脂肪酸抑制了乳球菌屬的生長(zhǎng);與此同時(shí),乳酸菌產(chǎn)生的苯乳酸、4-羥基-苯乳酸和環(huán)肽抑制了酵母菌的生長(zhǎng),其可能是導(dǎo)致Lactococcus與Galactomyces的相對(duì)含量呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)的原因[23]。但由于本實(shí)驗(yàn)的樣本數(shù)較少,確定發(fā)酵乳中細(xì)菌和真菌相互作用機(jī)理需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖7 3份傳統(tǒng)乳制品樣品中的真菌與細(xì)菌的相關(guān)關(guān)系Fig.7 The correlation between fungi and bacteria in three traditional fermented dairy products

3 結(jié)論

本研究采用高通量454焦磷酸測(cè)序技術(shù),對(duì)從新疆奇勒烏澤克鄉(xiāng)同一牧區(qū)采集的三份傳統(tǒng)發(fā)酵酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶樣品中的微生物多樣性、核心菌群及核心菌群間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn),酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬分別為L(zhǎng)actococcus、Lactobacillus和Lactobacillus,優(yōu)勢(shì)真菌屬依次為Galactomyces、Vanderwaltozyma和Galactomyces。三份傳統(tǒng)發(fā)酵乳中存在相似的優(yōu)勢(shì)菌屬,但其菌群結(jié)構(gòu)存在差異。在三份傳統(tǒng)發(fā)酵樣品中存在共有微生物群。且共有菌群中Lactococcus與Galactomyces、Lactococcus與Leuconostoc的相對(duì)含量存在顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05),而Leuconostoc與Galactomyces、Gibberella與Prevotella的相對(duì)含量存在顯著正相關(guān)(p<0.05)。上述研究成果為工業(yè)發(fā)酵劑的研發(fā),以及進(jìn)一步對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的菌群構(gòu)成、核心菌群及核心菌群間相關(guān)關(guān)系的研究有一定參考價(jià)值。

[1]張和平. 自然發(fā)酵乳制品中乳酸菌的生物多樣性[J]. 生命科學(xué),2015(7):837-846.

[2]張敏,張艷,蘭國(guó)偉,等. 高通量測(cè)序技術(shù)在乳制品微生物多樣性中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2016,32(32):48-52.

[3]Roh S W,Kim K H,Nam Y D,et al. Investigation of archaeal and bacterial diversity in fermented seafood using barcoded pyrosequencing[J]. Isme Journal,2010,4(4):1-16.

[4]李太君,高媛. 發(fā)酵乳制品發(fā)酵劑的研究進(jìn)展[J].中國(guó)乳業(yè),2014(4):59-61.

[5]楊彥榮. 應(yīng)用高通量測(cè)序研究西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳中微生物的多樣性[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

[6]Aldrete-Tapia A,Escobar-Ramírez M C,Tamplin M L,et al. High-throughput sequencing of microbial communities in Poro cheese,an artisanal Mexican cheese[J]. Food Microbiology,2014,44(6):136.

[7]Sun Z,Liu W,Bao Q,et al. Investigation of bacterial and fungal diversity in tarag using high-throughput sequencing[J]. Journal of Dairy Science,2014,97(10):6085-6096.

[8]Wu X H,Zhang L,Li Y,et al. A survey on composition and microbiota of fresh and fermented yak milk at different Tibetan altitudes[J]. Dairy Science & Technology,2009,89(2):201-209.

[9]王建光,孫玉江,芒來(lái). 馬奶與幾種奶營(yíng)養(yǎng)成份的比較分析[J]. 食品研究與開發(fā),2006,27(8):146-149.

[10]Oki K,Dugersuren J,Demberel S,et al. Pyrosequencing analysis of the microbial diversity of airag,khoormog and tarag,traditional fermented dairy products of mongolia[J]. Bioscience of Microbiota Food & Health,2014,33(2):53-64.

[11]Xu H,Liu W,Gesudu Q,et al. Assessment of the bacterial and fungal diversity in home-made yoghurts of Xinjiang,China by pyrosequencing[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture,2014,95(10):2007-2015.

[12]Liu W,Xi X,Sudu Q,et al. High-throughput sequencing reveals microbial community diversity of Tibetan naturally fermented yak milk[J]. Annals of Microbiology,2015,65(3):1741-1751.

[13]包秋華,王俊國(guó),劉文俊,等. 傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品曲拉中乳酸菌多樣性分析[J]. 中國(guó)乳品工業(yè),2016,44(7):12-14.

[14]呼斯楞,劉紅新,于潔,等. 內(nèi)蒙古呼倫貝爾地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中乳酸菌的多樣性分析[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2016,43(5):984-990.

[15]Jung M J,Nam Y D,Roh S W,et al. Unexpected convergence of fungal and bacterial communities during fermentation of traditional Korean alcoholic beverages inoculated with various natural starters[J]. Food Microbiology,2012,30(1):112.

[16]Illeghems K,Vuyst L D,Papalexandratou Z,et al. Phylogenetic Analysis of a Spontaneous Cocoa Bean Fermentation Metagenome Reveals New Insights into Its Bacterial and Fungal Community Diversity[J]. Plos One,2012,7(5):e38040.

[17]Li X R,Ma E B,Yan L Z,et al. Bacterial and fungal diversity in the traditional Chinese liquor fermentation process[J]. International Journal of Food Microbiology,2011,146(1):31-37.

[18]孫志宏,劉文俊,張和平. 基于宏基因組方法對(duì)西藏傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶中微生物多樣性的研究[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào),2012,30(4):19-24.

[19]烏仁圖雅. 應(yīng)用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品微生物多樣性的研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[20]張冬蕾.應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)新疆地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中微生物多樣性的研究[D]. 呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

[21]Dunny G M,Cleary P P,McKay L L. Genetics and molecular biology of streptococci,lactococci,and enterococci[M]. American Society for Microbiology,1991.

[22]賀銀鳳. 傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌和酵母菌的互作關(guān)系[J]. 中國(guó)乳品工業(yè),2010,38(10):43-45.

[23]Nielsen M S,Frisvad J C,Nielsen P V. Protection by fungal starters against growth and secondary metabolite production of fungal spoilers of cheese.[J]. International Journal of Food Microbiology,1998,42(1-2):91-99.