, ,*,

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院,青海西寧 810016;2.青海省農(nóng)林科學(xué)院,青海西寧 810016;3.青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海西寧 810016)

西藏靈菇是一種乳白色膠狀的顆粒物,形酷似米粒[1-2],是一種天然的酸奶發(fā)酵劑,屬于開菲爾的一個(gè)品系[3],有“西藏雪蓮”之稱[4]。其內(nèi)部是由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌共生而成的,在其生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生胞外多糖[5],而胞外多糖產(chǎn)生菌發(fā)酵的酸奶具有明顯改善酸奶的組織狀態(tài)和穩(wěn)定性的特點(diǎn)[6-7],因此,篩選和分離產(chǎn)胞外多糖乳酸菌成為現(xiàn)在發(fā)酵乳領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。而在西藏靈菇上棲息的微生物由于益生菌的種類不同、培養(yǎng)基不同,其產(chǎn)生的胞外多糖會(huì)存在明顯的差異[8-10]。目前研究大部分集中在西藏靈菇中產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌,包括嗜熱鏈球菌、馬乳酒樣乳桿菌和植物乳桿菌[11-14],而對(duì)西藏靈菇中酵母菌的分離和產(chǎn)胞外多糖特性的相關(guān)研究還未見報(bào)道。

本研究以前期實(shí)驗(yàn)分離得到的兩株產(chǎn)胞外多糖的單胞釀酒酵母菌為研究對(duì)象,但由于其生長(zhǎng)特性及發(fā)酵特性尚不明確,菌株有效合理的評(píng)價(jià)體系不完善,其應(yīng)用價(jià)值也受到了限制。因此,本研究通過對(duì)分離菌株生長(zhǎng)特性、產(chǎn)胞外多糖能力、發(fā)酵特性進(jìn)行研究,同時(shí)研究其菌株發(fā)酵制備的發(fā)酵乳的流變學(xué)特性,對(duì)于評(píng)價(jià)不同菌株發(fā)酵乳的質(zhì)地、黏彈性、穩(wěn)定性方面具有重要作用[15],旨在為分離自西藏靈菇中產(chǎn)胞外多糖的兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵酸乳的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供理論依據(jù),同時(shí),通過本研究篩選出具有應(yīng)用價(jià)值的菌株,為其后續(xù)開發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

酵母菌J5、J7由青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離得到,經(jīng)鑒定均為單胞釀酒酵母菌;脫脂乳培養(yǎng)基 將新鮮牛乳離心(4000 r/min條件下10 min),滅菌(105 ℃,20 min);YEPD培養(yǎng)基 葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯霉素 0.2 g、蒸餾水 1 L,105 ℃下滅菌20 min;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg) 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;鮮牛乳 采自青海省良種繁殖場(chǎng);Sevage試劑 氯仿∶正丁醇=5∶1 (V/V);其他試劑 均為分析純。

DHR流變儀 美國(guó)TA儀器;pHS-3C型精密酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;N4S紫外可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;LRH-150型生化培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;THZ-300C型恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;BCD-649WE型冰箱 青島海爾股份有限公司;DL-5M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;FD-1A-50型真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化 用接種環(huán)挑取保藏菌株兩環(huán),接種于100 mL液體YEPD培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)48 h進(jìn)行活化,活化2次。

1.2.2 兩株單胞釀酒酵母菌生長(zhǎng)特性研究 將兩株活化后的菌種以4%的接種量接入液體YEPD培養(yǎng)基,28 ℃下培養(yǎng),每3 h取樣,測(cè)定其在600 nm波長(zhǎng)處的吸光值(OD600值)及pH的變化[16]。

1.2.3 菌種胞外多糖的提取及多糖含量的測(cè)定

1.2.3.1 菌種胞外多糖的提取 胞外多糖的提取參照文獻(xiàn)[17-18]并改進(jìn)。兩株菌株以5%的接種量接入脫脂乳培養(yǎng)基,在28 ℃下培養(yǎng)48 h,得到的發(fā)酵乳在沸水浴中加熱15 min后,冷卻離心(4000 r/min,20 min),將離心后上清液中加入80%(w/v)的三氯乙酸至終濃度4%(w/v),4 ℃下靜置過夜后離心(8000 r/min,20 min);再向上清液中添加無水乙醇至終濃度75%(v/v),4 ℃靜置22 h后離心(8000 r/min,20 min),取離心后沉淀物,加入Sevage試劑除蛋白(樣品體積的1/5),濃縮液透析48 h后冷凍干燥得到胞外多糖粗品。

1.2.3.2 胞外多糖含量測(cè)定 胞外多糖含量的測(cè)定:采用苯酚-硫酸法[19]。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為:Y=0.0145X-0.0173,R2=0.9954。式中:Y為樣品的吸光度A;X為樣品中胞外多糖質(zhì)量濃度(mg/L)。

1.2.4 兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵性能測(cè)定 發(fā)酵劑的制備[20]:取兩環(huán)酵母菌的斜面菌種接種到裝有5 mL滅菌牛乳(105 ℃下滅菌20 min)試管中,28 ℃培養(yǎng)至大量氣泡產(chǎn)生時(shí)(高泡期),再以2%～3%的接種量移入100 mL滅菌牛乳中,28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至菌數(shù)達(dá)到(6～7)×107個(gè)/mL時(shí)即為酒母。再以5%接種量接入滅菌牛乳中進(jìn)行發(fā)酵,28 ℃培養(yǎng)30 h,4 ℃冷藏24 h得成品,測(cè)定2株菌發(fā)酵乳成品的發(fā)酵酸度、乙醇含量、pH及感官品質(zhì),同時(shí)探究?jī)芍陠伟劸平湍妇l(fā)酵乳的流變特性,確定兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵性能優(yōu)劣[21]。

1.2.4.1 發(fā)酵酸度的測(cè)定 采用0.1 mol/L NaOH滴定法測(cè)定發(fā)酵乳的酸度[22]。

1.2.4.2 乙醇含量測(cè)定 采用重鉻酸鉀氧化比色法[23]。

1.2.4.3 pH測(cè)定 采用pHS-3C型精密酸度計(jì)。

1.2.4.4 感官評(píng)定 根據(jù)2株菌制備的發(fā)酵乳的色澤、組織狀態(tài)、滋味與氣味給發(fā)酵乳評(píng)級(jí)打分(總分100分),評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表1[24],品嘗人員8名,取平均值,評(píng)價(jià)其菌株發(fā)酵性能差異。

1.2.5 發(fā)酵乳流變特性測(cè)定

1.2.5.1 兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵乳表觀粘度隨剪切速率變化的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[25-26]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。椎板(40 mm,1°),4 ℃下線性剪切,剪切速率為0.1～100 s-1,測(cè)定時(shí)間為300 s,連續(xù)測(cè)定30個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn),檢測(cè)樣品的表觀黏度隨剪切速率的變化情況。

1.2.5.2 兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵乳樣的剪切應(yīng)力隨剪切速率變化的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[25-26]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。椎板(40 mm,1°),4 ℃條件下線性剪切,檢測(cè)樣品剪切應(yīng)力隨剪切速率變化的情況:首先轉(zhuǎn)子的剪切速率由 0 s-1升高到600 s-1,采集30個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn),測(cè)試時(shí)間150 s;到達(dá)600 s-1后再降速到0 s-1,采集30個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn),測(cè)試時(shí)間150 s。

1.2.5.3 兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵乳頻率掃描測(cè)定 參考文獻(xiàn)[25-26]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。椎板(40 mm,1°),在4 ℃ 條件下,應(yīng)變?yōu)?.5%,頻率由0.1 Hz變化到10 Hz,對(duì)發(fā)酵乳樣品進(jìn)行頻率掃描,采集30個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。數(shù)據(jù)用DPS 6. 5進(jìn)行方差分析和多重比較,以p<0. 05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1兩株單胞釀酒酵母菌生長(zhǎng)特性研究

微生物OD600值是反映菌體生長(zhǎng)狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo),通常用來指菌體細(xì)胞密度,是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。兩株單胞釀酒酵母菌生長(zhǎng)曲線見圖1。由圖1可見,這兩株單胞釀酒酵母菌活菌數(shù)的變化符合細(xì)菌生長(zhǎng)典型規(guī)律。兩株單胞釀酒酵母菌的生長(zhǎng)規(guī)律基本一致,初期兩株單胞釀酒酵母菌在0～9 h生長(zhǎng)較為緩慢,無明顯生長(zhǎng)延遲期;9～15 h菌數(shù)增加較快,兩株酵母均在9 h后達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,酵母菌J5在15 h后進(jìn)入生長(zhǎng)平穩(wěn)期,而酵母菌J7相對(duì)延后,18 h后進(jìn)入生長(zhǎng)平穩(wěn)期。在整個(gè)生長(zhǎng)過程中,在0～12 h,J7的活菌數(shù)高于J5,J7生長(zhǎng)速度較快;隨著時(shí)間的延長(zhǎng)且在18 h后,J5與J7生長(zhǎng)趨勢(shì)接近,都進(jìn)入穩(wěn)定期,但J5活菌數(shù)略高于J7。

圖1 兩株單胞釀酒酵母菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of two Kazachstania unispora

2.2兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵過程中pH變化情況

兩株酵母菌不同發(fā)酵時(shí)間的pH變化見圖2。由圖2可知,兩株酵母菌均隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),其pH一直呈下降趨勢(shì)。在0～9 h期間兩株酵母菌下降幅度基本一致,都較為緩慢,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),酵母菌J7的pH在9 h后下降速度較快,產(chǎn)酸速度明顯高于J5;J5菌株pH基本保持平穩(wěn)下降趨勢(shì),下降幅度較小。由此可見,J7菌株發(fā)酵產(chǎn)酸能力明顯高于J5,J7適宜用于酸乳發(fā)酵生產(chǎn)。

圖2 兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵過程中pH變化曲線Fig.2 The pH change curves of two Kazachstania unispora in fermentation course

2.3兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量

兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖結(jié)果見圖3。由圖3可知,兩株單胞釀酒酵母菌產(chǎn)胞外多糖存在顯著差異(p<0. 05),其中酵母菌J5產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量較低為240.68 mg/L,酵母菌J7產(chǎn)胞外多糖較高,達(dá)到350.02 mg/L。與其他文獻(xiàn)[27-28]報(bào)道西藏靈菇中優(yōu)勢(shì)菌產(chǎn)胞外多糖含量相比,本研究分離得到的兩株單胞釀酒酵母菌具有更高的產(chǎn)胞外多糖的能力,且菌株J7多糖產(chǎn)量顯著高于菌株J5。

2.4兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵性能的比較

兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵特性比較見表2。由表2可知,兩株單胞釀酒酵母菌中,菌株J7發(fā)酵酸度較高,菌株J5稍弱,但二者產(chǎn)乙醇量無顯著差異。而在組織狀態(tài)和滋氣味上,菌株J7制備得到的發(fā)酵乳其組織狀態(tài)較好、滋氣味較佳,菌株J5的發(fā)酵乳滋氣味及組織狀態(tài)均較差。綜合考慮,菌株J7相對(duì)于菌株J5發(fā)酵性能優(yōu)良。

表2 兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵性能比較結(jié)果Table 2 The comparison in fermentation performance of two Kazachstania unispora

圖3 兩株單胞釀酒酵母菌產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量Fig.3 The exopolysaccharide production of two Kazachstania unispora注:不同字母表示差異顯著(p<0. 05)。

注:表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值,同列數(shù)據(jù)不同字母表示差異顯著(p<0.05)。2.5兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵乳的流變學(xué)特性研究

2.5.1 兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵乳表觀粘度隨剪切速率的變化 在食品的制備過程中,黏彈性的測(cè)量如表觀黏度的測(cè)量等提供了一種認(rèn)識(shí)食品的流變學(xué)特性的方法,同時(shí)也有利于消費(fèi)者對(duì)食品進(jìn)行初步評(píng)價(jià)[29]。在0.01～100 s-1的剪切速率下,對(duì)兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵乳進(jìn)行表觀粘度測(cè)定,結(jié)果見圖4。兩種發(fā)酵乳的表觀黏度都呈現(xiàn)隨剪切速率的延長(zhǎng)而降低的趨勢(shì),表現(xiàn)出剪切稀釋的特征。0～20 s-1,隨著剪切時(shí)間的延長(zhǎng)酵母菌J5表觀黏度下降較快,與J7相比下降幅度較大;在20 s-1之后,酵母菌J5、J7下降速度基本保持一致,但J5表觀黏度較J7下降較多,發(fā)酵乳的黏度大小依次為:J7發(fā)酵乳>J5發(fā)酵乳,說明菌株J7具有較高的表觀黏度,發(fā)酵性能較好。

圖4 兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵乳樣品表觀黏度隨剪切速率變化曲線Fig.4 Curves of apparent viscosity with shear rate for fermented dairy products from two Kazachstania unispora

2.5.2 兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵乳樣的剪切應(yīng)力隨剪切速率的變化 兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵乳的剪切應(yīng)力隨剪切速率的變化結(jié)果見圖5。由圖5可知,2 種發(fā)酵乳樣品的剪切應(yīng)力隨剪切速率的變化曲線都出現(xiàn)類似環(huán)狀曲線,形成觸變環(huán)。在觸變性實(shí)驗(yàn)中得到的觸變環(huán)其面積的大小可以代表樣品觸變性的情況,面積越大說明此樣品的結(jié)構(gòu)恢復(fù)速度越慢,越小則恢復(fù)速度越快。J5發(fā)酵乳、J7發(fā)酵乳的觸變環(huán)面積分別為377.63 Pa/s、346.96 Pa/s。從觸變環(huán)面積可以看出J5發(fā)酵乳與J7發(fā)酵乳觸變環(huán)面積相近,J7發(fā)酵乳觸變環(huán)面積相對(duì)較小,說明菌株J7發(fā)酵出的乳結(jié)構(gòu)恢復(fù)速度快,發(fā)酵性能好。

圖5 兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵乳樣品剪切應(yīng)力隨剪切速率變化曲線Fig.5 Curves of shear stress with shear rate for fermented dairy products from two Kazachstania unispora

2.5.3 兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵乳頻率掃描 兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵乳樣品的頻率掃描結(jié)果見圖6。由圖6可知,在0.1～10 Hz的線性粘彈性范圍內(nèi),隨著掃描頻率的增大,2個(gè)樣品的G′和G″都呈現(xiàn)增加趨勢(shì),且每個(gè)樣品的G′值都高于G″的值,體現(xiàn)出了類凝膠的特性。通過測(cè)定比較2種單胞釀酒酵母菌制備的發(fā)酵乳的粘彈性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)J7發(fā)酵乳G′及G″值均高于J5發(fā)酵乳的G′及G″值,表明,菌株J7制備的發(fā)酵乳具有較高的粘彈性,且J7具有更好的發(fā)酵性能。

圖6 兩株單胞釀酒酵母菌發(fā)酵乳樣品彈性模量G′和黏性模量G″隨頻率變化曲線Fig.6 Curves of elastic modulus and viscous modulus with frequency for fermented dairy products from two Kazachstania unispora

3 結(jié)論

從西藏靈菇中分離的兩株單胞釀酒酵母均具有較高的產(chǎn)胞外多糖的能力,菌株J7胞外多糖產(chǎn)量高于菌株J5,菌株J7的發(fā)酵特性明顯優(yōu)于菌株J5,且 J7發(fā)酵乳具有較好的組織狀態(tài)和滋氣味,綜合而言,菌株J7具有一定的應(yīng)用潛力。

2株單胞釀酒酵母菌為正觸變流體,其觸變環(huán)面積菌株J7<菌株J5,即J7發(fā)酵乳結(jié)構(gòu)恢復(fù)能力較強(qiáng);菌株J7發(fā)酵乳較菌株J5具有較高的表觀黏度;菌株J5及J7發(fā)酵乳的G′值都高于G″值,均表現(xiàn)類固體的特性,且菌株J7發(fā)酵乳表現(xiàn)出較高的黏性和彈性。

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