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(1.北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠,北京 101301;2.中國科學(xué)院微生物研究所,真菌學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100101)

清香型白酒是我國最古老的酒種之一,具有清香純正,醇甜柔和,自然諧調(diào),余味爽凈的特點(diǎn)[1]。牛欄山二鍋頭屬于清香型白酒,其釀造過程是開放式的多菌種固態(tài)發(fā)酵方式,以高梁等谷物為原料,大曲為糖化發(fā)酵劑,采用清蒸清茬釀造工藝、固態(tài)地缸發(fā)酵、清蒸流酒[2]。開放式的釀造過程有助于其網(wǎng)羅自然界的多種微生物,這些微生物在釀造過程中繁衍、代謝,形成了屬于牛欄山二鍋頭的獨(dú)特風(fēng)味。

真菌類微生物是白酒釀造中不可或缺的一類微生物,其在釀造過程中主要可分為絲狀真菌和酵母菌兩大類。目前普遍認(rèn)為,絲狀真菌是釀酒生產(chǎn)前期發(fā)酵原料中所含有的淀粉等大分子物質(zhì)降解的主要?jiǎng)恿?其分解后的產(chǎn)物可被其他微生物所利用,對(duì)產(chǎn)酒、產(chǎn)香存在促進(jìn)作用,同時(shí)絲狀真菌在生長代謝過程中會(huì)生成一些呈香物質(zhì),對(duì)風(fēng)味的形成做出貢獻(xiàn)[3-5]。酵母菌則被認(rèn)為是發(fā)酵前期產(chǎn)酒、生香的主力菌,在發(fā)酵過程中,酵母菌可以產(chǎn)生酒化酶作用于葡萄糖,通過糖酵解和丙酮酸無氧降解過程生成乙醇,其所分泌的酯化酶又能利用酒醅環(huán)境中的乙醇、酸等底物通過酯化過程合成多種風(fēng)味物質(zhì)[6-9]。可以看出,真菌微生物在白酒發(fā)酵中涵蓋了糖化、產(chǎn)酒、生香這幾個(gè)重要過程,所以對(duì)白酒釀造中真菌微生物進(jìn)行研究有助于我們系統(tǒng)的解析白酒釀造過程。

傳統(tǒng)微生物分離是白酒微生物研究中較為常用的技術(shù)手段,它主要適用于發(fā)酵中可培養(yǎng)類微生物,可以有效地確定微生物的變化規(guī)律并獲得活體菌株。高通量測(cè)序技術(shù)可以對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析,可以快捷方便的讀取樣品中復(fù)雜的微生物結(jié)構(gòu),具有明顯的先進(jìn)性和優(yōu)勢(shì),是分析復(fù)雜多菌種樣品的首選方法[10]。目前,高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用于各種分子生物學(xué)領(lǐng)域,包括人體微生物研究方面、水中生物、土壤微生物群落研究等[11-12]。

本文利用傳統(tǒng)微生物分離方法和高通量測(cè)序技術(shù),分析了牛欄山二鍋頭發(fā)酵過程中真菌的演替規(guī)律。將兩種方法結(jié)果相結(jié)合,確定了發(fā)酵過程中真菌的變化規(guī)律及優(yōu)勢(shì)微生物,為清香型白酒優(yōu)良真菌微生物的篩選及其功能性研究提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

冬季大茬發(fā)酵酒醅(第一次入缸發(fā)酵的高粱) 牛欄山酒廠;氯仿、異戊醇、異丙醇均為分析純 購于上海生工生物工程有限公司;YPD培養(yǎng)基:酵母浸粉10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水1 L;PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯浸提液500 mL,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水500 mL;孟加拉紅培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;FastDNA SPIN Kit for Soil(MP bio土壤基因組DNA提取試劑盒) 北京比特博生物技術(shù)有限公司。

BSC-1100ⅡA2型生物安全柜 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;快速梯度基因擴(kuò)增儀(梯度C1000)、基礎(chǔ)型水平電泳儀 美國BIORAD公司;全自動(dòng)凝膠成像儀 美國BIORAD公司;1-14k高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;SPX-320型生化培養(yǎng)箱 寧波江南;DW-86L828W冷水之星 海爾超低溫冰箱;樣品快速制備系統(tǒng) 美國MP FastPrep-24。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵酒醅真菌分離 取樣:根據(jù)大茬發(fā)酵溫度曲線特點(diǎn),從整個(gè)發(fā)酵周期28 d中確定七個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集樣品,分別為0、3、7、13、19、23、28 d,選取同批次發(fā)酵的三缸作為取樣缸(平行對(duì)照),取樣位置為地缸中心點(diǎn)距地缸表面60 cm處,樣品編號(hào)為D3A、D3B、D3C其余取樣點(diǎn)以此類推(入池0 d初始樣品,只取一份即可)。

分離:稱取發(fā)酵酒醅樣品10 g于90 mL無菌水稀釋,擬定為10-1梯度。依次稀釋為10-2、10-3、10-4、10-5梯度,分別吸取10-3、10-4、10-5梯度稀釋液0.1 mL,涂布于相應(yīng)分離篩選培養(yǎng)基平板上。

培養(yǎng):將涂布分離好的平皿按照常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng),培養(yǎng)的微生物包括絲狀真菌、酵母菌。培養(yǎng)溫度分別為絲狀真菌30 ℃、酵母28 ℃,培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)菌落的生長情況而定,一般為24～48 h[13]。

計(jì)數(shù)及挑菌:根據(jù)選擇培養(yǎng)的結(jié)果,酵母菌以10-4板,絲狀真菌以10-3板為主計(jì)數(shù)。根據(jù)絲狀真菌和酵母菌形態(tài)差異,將不同形態(tài)真菌分類別單獨(dú)挑取計(jì)數(shù)[14-15],采用PCR隨機(jī)鑒定20～30株,確定該類別酵母準(zhǔn)確分類,并根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算不同微生物的種群數(shù)量。其余梯度每個(gè)平板挑取不同形態(tài)的單菌落,接種在斜面上28 ℃培養(yǎng)2 d,挑取新鮮的純菌接種至20%無菌甘油管-80 ℃超低溫冰箱保藏。

1.2.2 真菌PCR擴(kuò)增及測(cè)序

1.2.2.1 酵母DNA提取方法 接取少量活化的菌體,于1.5 mL離心管內(nèi);加入100 μL裂解液(100 mmol/L Tris,30 mmol/L EDTA,0.5% SDS,pH8.0,115 ℃滅菌30 min備用);100 ℃水浴15 min;加入100 μL 2.5 mol/L的醋酸鉀溶液,冰浴60 min;4 ℃下12000×g離心5 min,取上清液200 μL至0.5 mL離心管中;加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1),劇烈振蕩10 min,12000×g離心15 min,移取100 μL上清液至0.5 mL離心管中;加入100 μL預(yù)冷的異丙醇,混勻后-20 ℃下放置20 min;12000×g離心15 min,棄去上清;用70%的酒精洗滌沉淀兩次;沉淀過夜自然干燥;加入50 μL已滅菌的超純水,室溫下溶解1 h,-20 ℃冰箱儲(chǔ)藏備用[16-17]。

1.2.2.2 絲狀真菌DNA提取方法 采用土壤基因組DNA提取試劑盒FastDNA SPIN Kit for SoiL試劑盒提取。

1.2.2.3 PCR擴(kuò)增及鑒定 對(duì)所提取的真菌DNA進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)和ITS區(qū)片段擴(kuò)增,酵母菌采用通用引物NL1/NL4,絲狀真菌采用通用引物ITS5/ITS4,如表1所示。

PCR反應(yīng)條件:94 ℃加熱3 min使模板DNA變性,然后進(jìn)入下列溫度循環(huán):94 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后在72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序后,用Chromas軟件分析測(cè)序質(zhì)量,去除峰圖不可靠的部分對(duì)DNA序列進(jìn)行手動(dòng)校正,用校正后的序列在NCBI(http://www.ncbi.nLm.nih.gov/bLast)中進(jìn)行同源序列搜索。

表1 真菌PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence of fungi

1.2.3 大茬發(fā)酵酒醅高通量測(cè)序 稱取1 g不同發(fā)酵期酒醅樣品,經(jīng)Fastprep處理后,采用土壤基因組DNA提取試劑盒(FastDNA SPIN Kit for SoiL)提取總NDA。濃度檢測(cè)合格后,送北京奧維森公司對(duì)真菌Its1-Its2區(qū)行高通量測(cè)序,利用Illumina MiSeq PE300進(jìn)行高通量測(cè)序得到原始測(cè)序序列,通過Fastqc進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)去除低質(zhì)量Reads(過濾標(biāo)準(zhǔn):Q20≥ 90%)。通過Cope軟件(Connecting Overlapped Pair-End,V1.2.3.3),進(jìn)行序列拼接及過濾后利用Mothur軟件以平均鄰近聚類算法(Average Neighbor Clustering Algorithm)在0.03(或97%的相似度)水平下對(duì)Clean Tags進(jìn)行OTU(OperationaL Taxonomic Units)的聚類,統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品每個(gè)OTU中的豐度信息。選取分析數(shù)據(jù)中每個(gè)OTU中一個(gè)有代表性的序列,通過BLast比對(duì),獲得每一個(gè)OTU種名。將OTU按Reads數(shù)進(jìn)行降序排列,選取數(shù)量前8 的OTU進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[18-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1大茬發(fā)酵溫度曲線

從圖1可以看出大茬發(fā)酵溫度曲線呈現(xiàn)前緩升、中挺、后緩落的趨勢(shì),是清香型白酒較為理想的升溫曲線,即發(fā)酵升溫應(yīng)逐步上升,至主發(fā)酵期,溫度應(yīng)穩(wěn)定一個(gè)時(shí)期,隨后進(jìn)入后發(fā)酵期,發(fā)酵溫度緩慢下降,直至出缸蒸餾[20]。發(fā)酵的0～9 d屬于溫度緩升期,緩慢升溫有利于控制酒醅生酸,維持正常發(fā)酵的進(jìn)行;9～13 d屬于中挺階段,是主發(fā)酵期和后發(fā)酵期的交接期;13～28 d為后緩落期,該階段酒精發(fā)酵基本結(jié)束主要以產(chǎn)香為主[21]。本研究選取的7個(gè)取樣點(diǎn)分別涵蓋了發(fā)酵的3個(gè)階段,對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程具有較好的代表性。

圖1 大茬發(fā)酵溫度及取樣點(diǎn)Fig.1 Fermentation temperature and sampling point of fermented grains

2.2大茬發(fā)酵真菌數(shù)量變化規(guī)律

本實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)真菌形態(tài)和PCR分類結(jié)果將發(fā)酵過程中真菌分為4大類,分別為:扣囊覆膜酵母、釀酒酵母、生香酵母(扣囊覆膜酵母和釀酒酵母之外的酵母菌)和絲狀真菌。通過圖2可以看出,在大茬發(fā)酵過程中,入池階段主要真菌是扣囊覆膜酵母和絲狀真菌,這兩類真菌在發(fā)酵前期數(shù)量較多,在7 d后數(shù)量開始減少,在13 d已經(jīng)很難分離到;生香酵母在入池階段無法分離到,隨著發(fā)酵的進(jìn)行數(shù)量開始快速增長,在發(fā)酵第7 d,數(shù)量達(dá)到頂峰(1.63 log cfu/g),隨后數(shù)量開始減少,在13 d后已經(jīng)分離不到;釀酒酵母同樣在入池階段無法分離到,隨后開始快速增長,在13 d數(shù)量達(dá)到頂峰(7.55 log cfu/g),此時(shí)扣囊覆膜酵母、絲狀真菌和生香酵母在酒醅中已無法分離到,在發(fā)酵后期釀酒酵母數(shù)量出現(xiàn)下降趨勢(shì),但在出池階段仍保持在5.5 log cfu/g;整體看來,釀酒酵母是大茬發(fā)酵中期和后期的主要真菌。

圖2 大茬發(fā)酵真菌數(shù)量變化Fig.2 Quantity changes of fungi in Dacha fermentation

2.3大茬發(fā)酵生香酵母和絲狀真菌種類變化圖

生香酵母在發(fā)酵過程中主要活躍在0～7 d,在入池階段和13 d無法分離到。在本次實(shí)驗(yàn)中共分離到478株生香酵母,共分為10個(gè)種。通過圖3可以看出在生香酵母最為活躍的階段,主要種類是由畢赤類酵母組成,包括:Pichiakudriavzevii、Pichiafermentans、Pichiafarinosa,同時(shí)還含有一定量的TorulasporadeLbrueckii、Candidahumilis、Kazachstaniaservazzii及Wickerhamomycesanomalus,其余種類酵母相對(duì)較少。

圖3 大茬發(fā)酵生香酵母Fig.3 Aroma-producing yeasts of Dacha fermentation

由于絲狀真菌只存在發(fā)酵前期,且難以通過肉眼判斷其種類,所以將發(fā)酵前期所分離到的絲狀真菌共同分析。從0 d和7 d樣品中共分離到絲狀真菌5個(gè)種,共81株。其中Lichtheimiacorymbifera62株。其余Rhizopusarrhizus和Mucorcircinelloides等數(shù)量較少?？梢钥闯鯨.corymbifera是發(fā)酵過程中主要絲狀真菌。

表2 大茬發(fā)酵絲狀真菌Table 2 Filamentous fungi of Dacha fermentation

2.4大茬酒醅高通量測(cè)序結(jié)果

本次高通量實(shí)驗(yàn)中,共獲得143種真菌OTU,主要包括酵母目、毛霉目、散囊菌目和絲孢酵母目,挑選Reads數(shù)前8的OTU進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,分別為S.fibuligera、S.cerevisiae、Naumovozymacastellii、K.servazzii、C.humilis、P.kudriavzevii、Candidatropicalis和L.corymbifera。

如圖4所得,在0 d入池階段,上述8種真菌均能在酒醅中檢測(cè)到,其中S.fibuligera和P.kudriavzevii是主要真菌;在第3 d,S.fibuligera所占比例繼續(xù)增加,成為了酒醅中的主體真菌;第7 d,S.cerevisiae、Naumovozymacastellii、K.servazzii和C.humilis數(shù)量出現(xiàn)增長,S.fibuligera所占比例雖有下降,但仍為酒醅內(nèi)主體真菌;隨著發(fā)酵的進(jìn)行,在13 d頂火期S.fibuligera快速下降,S.cerevisiae成為發(fā)酵中的主體真菌,K.servazzii和C.humilis變化不大;在隨后19～28 d,雖然S.fibuligera、N.castellii和C.humilis數(shù)量稍有增長,但S.cerevisiae繼續(xù)保持較高的數(shù)量關(guān)系至出池,是頂火后期的主要真菌。

圖4 基于高通量測(cè)序結(jié)果的大茬酒醅真菌物種多樣性和演替Fig.4 Fungal diversity and succession in Dacha fermentation process based on high throughput sequencing of ITS libraries注：A、B、C分別表示同一取樣點(diǎn)平行樣品。

通過以上結(jié)果可以得出,酒醅發(fā)酵的0～7 d是溫度緩升階段,酒醅內(nèi)真菌多樣性較為豐富,傳統(tǒng)分離方法表明該階段主要真菌包括S.fibuligera、S.cerevisiae、絲狀真菌類的L.corymbifera、R.arrhizus和生香酵母類的P.kudriavzevii、P.fermentans、P.farinosa,雖然生香酵母和S.cerevisiae在0 d后快速增長,但該階段的主體真菌為S.fibuligera和L.corymbifera。高通量測(cè)序結(jié)果同樣表明了S.fibuligera是發(fā)酵前期的主體真菌。在13 d頂火期～28 d發(fā)酵結(jié)束階段,傳統(tǒng)分離和高通量測(cè)序均表明S.cerevisiae為該階段的主體真菌。兩種分析手段共同確定了S.fibuligera和S.cerevisiae是牛欄山二鍋頭發(fā)酵前期和中后期的主要真菌,但在其余真菌數(shù)量關(guān)系上存在一定差異,如:傳統(tǒng)分離結(jié)果表明L.corymbifera同樣是發(fā)酵前期的主要真菌,而高通量測(cè)序結(jié)果中L.corymbifera在發(fā)酵前期所占比例較低;在發(fā)酵中后期,酒醅內(nèi)已難以分離到S.cerevisiae以外的酵母,而高通量測(cè)序結(jié)果則依然表明在該階段酒醅中含有一定量的S.fibuligera、N.castellii和C.humilis。分析認(rèn)為,在發(fā)酵過程中,酵母死亡后未降解DNA影響了高通量測(cè)序的比例關(guān)系,造成了傳統(tǒng)分離結(jié)果與高通量測(cè)序出現(xiàn)差異現(xiàn)象。

3 結(jié)論與討論

本文采用傳統(tǒng)分離方法結(jié)合26S rDNA D1/D2區(qū)和ITS區(qū)基因序列分析方法和高通量測(cè)序技術(shù)共同分析了牛欄山二鍋頭大茬發(fā)酵不同時(shí)期真菌多樣性組成。研究結(jié)果表明,發(fā)酵前期升溫階段是酒醅真菌多樣性較為豐富的時(shí)期,主要為S.fibuligera、S.cerevisiae和以L.corymbifera為主的絲狀真菌及以畢赤酵母為主的生香酵母,其中S.fibuligera和L.corymbifera是主體真菌,在發(fā)酵中期和后期,酒醅內(nèi)已很難分離到除S.cerevisiae以外的真菌,S.cerevisiae則成為發(fā)酵后期的主體真菌。

本研究利用傳統(tǒng)分離技術(shù)結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)共同對(duì)大茬發(fā)酵真菌多樣性進(jìn)行系統(tǒng)研究,有效的彌補(bǔ)了兩種分析方法的不足,如傳統(tǒng)的分離方法雖然可從酒醅中分離到活體微生物,但培養(yǎng)基的配制較難模擬出酒醅整體環(huán)境的復(fù)雜性,無法獲得準(zhǔn)確微生物多樣性,而分子生態(tài)學(xué)技術(shù)僅集中于微生物結(jié)構(gòu)的分析,雖然能夠全面地解析微生物多樣性,但由于其無法區(qū)分活體與死亡的微生物DNA片段,很容易造成結(jié)果與真實(shí)值出現(xiàn)偏差。采用兩種方法相結(jié)合可以較為準(zhǔn)確的獲得發(fā)酵過程中真菌多樣性及變化規(guī)律,有助于我們解析發(fā)酵過程中不同真菌微生物的作用,為今后的強(qiáng)化添加、菌種篩選以及機(jī)械化生產(chǎn)提供理論支撐。

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