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(1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,貴州貴陽 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點實驗室,貴州貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心,貴州貴陽 550004)

隨著人們生活日益富裕,對豬肉的需求量也越來越多。然而,動物源性食品獸藥殘留的安全問題也日益突顯,嚴(yán)重危害著公共衛(wèi)生安全及人體健康,引起了各方面的高度關(guān)注[1-2]。獸藥作為預(yù)防、治療、診斷畜禽等動物疾病藥物,在養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮著重要的作用,但是由于養(yǎng)殖者合理用藥知識缺乏或經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使,濫用獸藥的現(xiàn)象在養(yǎng)殖業(yè)中時有發(fā)生[3-7]。

氯霉素和磺胺類藥物由于具有抗菌譜廣、價格低廉和性質(zhì)穩(wěn)定等特點,成為畜禽抗感染治療中的重要藥物[8-9]。但是,這些藥物的不當(dāng)使用會造成其在動物組織中富集,可直接或間接地通過環(huán)境和食物鏈的作用對人體產(chǎn)生一定的毒副作用,引起細(xì)菌耐藥性的增加。目前,國內(nèi)外報道的檢測動物源性食品中氯霉素或磺胺類藥物殘留的檢測方法主要有液相色譜法(HPLC)、高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)[10-13]等。由于LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確、快速和高效的優(yōu)點,在很大程度上提高了分析能力和分析效率,在殘留分析技術(shù)上應(yīng)用廣泛。目前,氯霉素和磺胺類藥物是常監(jiān)控的獸藥,但是它們的檢測方法是兩種獨立的方法,若能合并檢測,將提高分析效率。

因此,本實驗建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法同時檢測豬肉中氯霉素和5種磺胺類藥物(磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺噻唑、甲氧芐啶和磺胺嘧啶),該方法快速簡便、定量準(zhǔn)確、靈敏度高,縮短了樣品前處理和進(jìn)樣時間,提高了分析能力和分析效率,以保障對該類藥物的殘留監(jiān)控。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲氧芐啶(≥99.9%)、磺胺甲嘧啶(≥98%)、磺胺噻唑(≥98.0%) 大連美侖生物有限公司；磺胺二甲嘧啶(≥100.0%)、磺胺嘧啶(≥99.7%) 中國食品藥品檢定研究院；氯霉素(≥98.5%)、氯霉素-D5(≥99.0%，100 μg/mL) Dr.Ehrenstorfer；乙腈 色譜純,德國Merck 公司;豬肉 北京華聯(lián)超市(經(jīng)測定不含甲氧芐啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、氯霉素)。

TQ Detector/ESI+型超高液相色譜儀三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司;Allegra 64R低溫高速離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司;AE240十萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;KNSY0020超純水機(jī) 四川沃特爾科技發(fā)展有限公司;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 準(zhǔn)確吸取100 μg/mL的氯霉素-D5溶液1 mL,氮氣吹干后,加乙腈定容至25 mL棕色容量瓶中,得4 μg/mL的氯霉素-D5儲備液,然后將儲備液制備成8 ng/mL的工作液。

1.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取氯霉素9.6 mg、甲氧芐啶10.4 mg、磺胺二甲嘧啶10.4 mg、磺胺甲嘧啶10.2 mg和磺胺噻唑10.2 mg,加乙腈分別定容至10 mL,分別得到濃度為0.96、1.04、1.04、1.02、1.02 mg/mL的氯霉素、甲氧芐啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺噻唑的標(biāo)準(zhǔn)儲備液;精密稱取磺胺嘧啶9.5 mg,加乙腈定容至100 mL,得到濃度為95 μg/mL磺胺嘧啶的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。將儲備液制備成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(氯霉素、磺胺二甲嘧啶、甲氧芐啶、磺胺甲嘧啶、磺胺噻唑和磺胺嘧啶分別為0.192、10.4、10.4、10.2、10.2、9.5 μg/mL),再按倍數(shù)稀釋至表1中系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表1 6種獸藥系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度Table 1 The series concentration of six kinds of veterinary medicines

1.2.3 分析條件 色譜條件:色譜柱:Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:45 ℃;流動相A:乙腈;流動相B:水;流速:0.35 mL/min;梯度洗脫程序:0～1.5 min用20%～38% A;1.5～2 min用38%～95% A;2～3 min用95% A;3～5 min用95%～20% A。質(zhì)譜條件:電噴霧電離源(ESI);毛細(xì)管電離電壓(3 kV);離子源溫度(120 ℃),去溶劑氣(氮氣,650 L/h),去溶劑氣溫度(350 ℃),碰撞氣(氬氣,0.16 mL/min),掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)。氯霉素和五種磺胺類藥物用于定量分析的監(jiān)測離子見表2。

表2 質(zhì)譜分析條件Table 2 Mass spectrometric conditions of six kinds of veterinary medicines

1.2.4 豬肉前處理 稱取5.00 g豬肉,置于50 mL離心管中,加入8 ng/mL氯霉素-D5100 μL后,加入10 mL乙酸乙酯后勻漿,渦混3 min,90 Hz超聲5 min,6000 r/min離心5 min,轉(zhuǎn)移上清液至另一試管中,下層重復(fù)以上操作,合并乙酸乙酯,有機(jī)層用氮吹儀在40 ℃下吹干,殘渣用0.4 mL 10%乙腈水超聲溶解,加0.5 mL正己烷除脂,6000 r/min離心5 min,棄上層,下層過0.22 μm微孔濾膜,UPLC-MS/MS進(jìn)樣分析。

1.2.5 方法的適用性 分別取6份空白豬肉5.00 g,除不加內(nèi)標(biāo)外,其余按“1.2.4”項操作,獲得空白豬肉色譜圖。將標(biāo)準(zhǔn)溶液(氯霉素、磺胺二甲嘧啶、甲氧芐啶、磺胺甲嘧啶、磺胺噻唑和磺胺嘧啶分別為4.8、260、260、255、255、237.5 ng/mL)和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白豬肉,同上操作得加標(biāo)豬肉色譜圖。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 分別取6份空白豬肉5.00 g,除不加內(nèi)標(biāo)外,其余按“1.2.4”項操作,獲得空白豬肉基質(zhì)。分別將100 μL內(nèi)標(biāo)溶液和“1.2.2”中系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入至空白豬肉基質(zhì)中。5種磺胺類藥物采用外標(biāo)法定量,氯霉素采用內(nèi)標(biāo)法定量。以5種磺胺類藥物的峰面積為縱坐標(biāo)Y,各物質(zhì)濃度(C)為橫坐標(biāo)X進(jìn)行直線回歸;以氯霉素的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(A/Ai)為縱坐標(biāo)Y,各物質(zhì)濃度(C)為橫坐標(biāo)X進(jìn)行直線回歸,求得直線方程,即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。氯霉素等6種成分的定量限(LOQ)定義為S/N≥10,檢測限(LOD)定義為S/N≥3。

1.2.7 方法的準(zhǔn)確度和精密度 取空白豬肉5.00 g,按“1.2.2”項分別配制6種成分低、中、高三個濃度的樣品,按“1.2.4”項下操作,每一個濃度進(jìn)行6樣本分析,日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣,并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時進(jìn)行。每個系列濃度做6份,計算日內(nèi)精密度;3種濃度連續(xù)測定3 d,計算日間精密度。

1.2.8 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 取空白豬肉5.00 g,按“1.2.2”項下分別配制6種成分低、中、高三個濃度的樣品,每個濃度平行測定5份,按“1.2.4”項下操作(A樣品);另取空白豬肉5.00 g,除不加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液外,其余按“1.2.4”項下操作,向獲得的上清液中加入相應(yīng)低、中、高濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo),吹干,殘留物以0.4 mL 10%乙腈水溶解(B樣品);另取上述低、中、高濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo),吹干,殘留物以0.4 mL 10%乙腈水溶解(C樣品)。A樣品與B樣品色譜峰面積之比為提取回收率,B樣品與C樣品的色譜峰面積之比為基質(zhì)效應(yīng)。

1.2.9 穩(wěn)定性 取空白豬肉5.00 g,按“1.2.2”項下分別配制6種成分低、中、高三個濃度的樣品,樣品處理后置于自動進(jìn)樣器中,在0、6 h分別進(jìn)樣,以考察處理后樣品在自動進(jìn)樣器條件下的穩(wěn)定性,每一濃度分析5個樣本。同法配制低、中、高三個濃度的樣品,分別在室溫(約20 ℃)下放置6 h,4 ℃下冷藏8 h,凍融循環(huán)3次,經(jīng)處理后進(jìn)樣測定,以考察樣品中各指標(biāo)成分在室溫,冷藏,反復(fù)凍融條件下的穩(wěn)定性,每一濃度分析5樣本。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的適用性

進(jìn)樣檢測得到空白豬肉色譜圖1(A)和加標(biāo)豬肉色譜圖1(B)?？瞻棕i肉在6種藥物及其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的出峰位置均沒有干擾峰,方法的專屬性較高,加標(biāo)樣品中磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲嘧啶、甲氧嘧啶、氯霉素和氯霉素-D5的保留時間分別為1.55、1.93、2.24、2.78、2.93、3.14、3.14 min,出峰時間穩(wěn)定,分離完全。

圖1 空白豬肉樣品(A)和加標(biāo)豬肉樣品(B)的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of the blank sample(A)and the sample added six kinds of veterinary medicines(B)注:1.磺胺嘧啶;2.磺胺噻唑;3.磺胺甲嘧啶;4.甲氧嘧啶; 5.磺胺二甲嘧啶;6.氯霉素-D5;7.氯霉素。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

在本方法所確定的條件下,5種磺胺類藥物以峰面積為縱坐標(biāo),基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)作圖;氯霉素和內(nèi)標(biāo)的特征離子質(zhì)量色譜峰面積比為縱坐標(biāo),基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)作圖,各藥物均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,見表3。

氯霉素和5種磺胺類藥物分別在9.6～384 ng/kg和0.51～20.8 μg/kg濃度呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.99以上(表3)。氯霉素的檢測限為3.2 ng/kg,5種磺胺類藥物檢測限為0.158～0.173 μg/kg,氯霉素的定量限為9.6 ng/kg,5種磺胺類藥物定量限0.475～0.52 μg/kg。

表3 6種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 Linear equations and correlation coefficients of six kinds of veterinary medicines

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

表4 6種藥物在血漿中的準(zhǔn)確度、日內(nèi)和日間精密度(n=6,3 days)Table 4 Intra-and inter-day precision and accuracy of six kinds of veterinary medicines(n=6,3 days)

結(jié)果表明6種藥物的準(zhǔn)確度范圍為85.21%～93.04%,日內(nèi)和日間精密度RSD(%)均小于5%,提示該方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。測定結(jié)果見表4。

2.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

空白豬肉樣品中分別加入高、中、低3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實驗,方法平均回收率為70.84%～103.99%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.98%～8.01%,實驗結(jié)果表明各藥物提取回收率良好,無明顯的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見表5。

2.5 穩(wěn)定性實驗

各濃度下的樣品在室溫下放置6 h,4 ℃冷藏8 h,凍融3次以及自動進(jìn)樣器中放置6 h后穩(wěn)定性考察結(jié)果見表6,結(jié)果表明含6種藥物的樣品在上述放置條件下穩(wěn)定。

3 討論

3.1 豬肉前處理條件的優(yōu)化

提取殘留藥物時一般使用甲醇、乙腈溶液[14-18],本實驗考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯等提取液,實驗結(jié)果表明使用乙酸乙酯的回收率較高,且無雜質(zhì)峰干擾。在溶解殘渣時加入正己烷進(jìn)一步除去豬肉樣品中的雜質(zhì)。

表5 6種藥物的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)(n=5)Table 5 Added recovery and matrix effects of six kinds of veterinary medicines in pork(n=5)

表6 6種藥物的穩(wěn)定性(n=5)Table 6 Stability of six kinds of veterinary medicines in pork(n=5)

3.2 液相條件優(yōu)化

對于多組分分析,采用梯度洗脫易于藥物的分離。本方法以Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)作為色譜柱。考察了0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-水、乙腈-水四種流動相體系,經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn),乙腈-水能獲得較好的峰型和較高的響應(yīng)。

3.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

實驗采用各個藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液在電噴霧離子源下進(jìn)行全掃描,確定準(zhǔn)分子離子。以分子離子為母離子對子離子全掃描,在多反應(yīng)檢測模式下對其質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。得到各藥物靈敏度較高的質(zhì)譜條件。

4 結(jié)論

本實驗采用超高效液相色譜-串聯(lián)四級質(zhì)譜聯(lián)用儀,建立了豬肉中6種獸藥殘留量測定方法。樣品前處理采用液-液萃取的方法,與固相萃取法相比,能大大降低實驗成本,并且縮短了樣品前處理時間。樣品分析時間僅為5 min,與傳統(tǒng)液相色譜方法相比,分離效率高、極大地縮短了分析時間。并且,該方法線性、回收率均能滿足檢測要求,該法簡便、快速、準(zhǔn)確,可用于豬肉中氯霉素、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺噻唑、甲氧芐啶和磺胺嘧啶藥物殘留的檢測。

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