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(1.貴港出入境檢驗檢疫局,廣西貴港 537100; 2.廣西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,廣西南寧 530028)

色素可以分為天然色素和人工合成色素。人工合成色素具有著色力強、性質(zhì)較穩(wěn)定、結(jié)合牢固、成本低廉等特點,因此在食品著色方面有著廣泛的應用。但超標、超范圍使用會造成人體被動攝入過量的食用合成色素,導致出現(xiàn)噯氣、偏頭痛、多種過敏癥狀以及中毒等癥狀,更有甚者造成致癌、致畸、致突變等危害[1-3],所以其安全性日益受到重視。歐美、日本和我國等對合成色素允許使用的食品種類和最大使用量都做出了相應的規(guī)定[4]。我國《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》(GB 2760-2014)[5]對人工合成色素的使用范圍及最大使用限量作了明確規(guī)定,但部分食品生產(chǎn)中仍然存在超范圍或超量使用的情況。一些不良商家為了謀求高利潤或使肉制品的外觀更鮮艷,將不允許添加的色素添加到肉制品中。

目前《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》(GB 5009.35-2016)[6]方法不適用肉制品的前處理,行業(yè)標準《食品中的誘惑紅、酸性紅、亮藍、日落黃的含量檢測 高效液相色譜法》(SN/T 1743-2006)[7]也只適用于糖果和飲料色素的檢測,國家標準《肉制品 胭脂紅著色劑測定》(GB/T 9695.6-2008)[8]只是規(guī)定了肉制品中胭脂紅著色劑的測定方法,而對其他種類的合成著色劑未作規(guī)定,且其前處理方法過程繁瑣、工作效率低。文獻[9-16]報道了幾種合成色素的檢測方法,但未見有同時測定檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和酸性紅這6種色素的報道。本研究通過優(yōu)化樣品提取和測定條件,建立了一套快速準確同時測定肉制品中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和酸性紅6種人工合成色素的高效液相色譜方法,以期為肉制品中人工合成色素的高通量測定提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肉制品 在廣西范圍內(nèi)市場隨機采購;無水乙醇 色譜純,天津光復精細化工研究所;氨水 分析純,廣東光華科技股份有限公司;乙腈 色譜純,美國天地有限公司;乙醚 分析純,四川西隴化工有限公司;乙酸銨 分析純,廣東光華科技股份有限公司;檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃溶液標準物質(zhì) 濃度0.500 mg/mL,中國計量科學研究院;誘惑紅標準品(純度80.0%)、酸性紅標準品(純度95.4%) 德國Dr.Ehrenstorfer;乙醇-氨-水溶液(7∶1∶2,v/v);超純水 自制。

Agilent 1260型高效液相色譜儀(帶二極管陣列檢測器) 美國Agilent公司;GM 200刀式研磨儀 德國RETSCH(萊馳)公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;L550臺式低速大容量離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;LPD2500多管旋渦混合儀 萊普特科學儀器(北京)有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;ML204/02電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 稱取絞碎的肉制品10 g(精確至0.01 g)放入50 mL塑料離心管中,加入15 mL乙醚,在混勻器上混勻3 min,棄去乙醚,反復處理3次清除脂肪。用氮氣將乙醚揮盡后,加25 mL乙醇-氨-水(7∶1∶2,v/v)溶液,漩渦混勻1 min后超聲(頻率40 KHz)提取30 min,4000 r/min離心5 min,上清液移入100 mL燒杯,殘渣繼續(xù)用乙醇氨水溶液提取,至提取液無明顯顏色。合并上清液于100 mL燒杯中,將提取液置于90 ℃水浴,揮至近干。再加25 mL乙醇氨溶液,振蕩混勻后4000 r/min離心5 min,收集上清液于90 ℃水浴蒸至2 mL左右,用水稀釋至10 mL,取適量經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,待測。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:Agilent Poroshell 120 SB-C18(4.6 mm×150 mm,2.7 μm);柱溫:35 ℃;流動相:A相為0.02 mol/L乙酸銨溶液,B相為乙腈,流速:0.8 mL/min;梯度洗脫程序:0 min 95% A,5 min 80% A,10 min 80% A,15 min 95% A;進樣量:10.0 μL;二極管陣列檢測器;檢測波長:檸檬黃 428 nm,莧菜紅520 nm,胭脂紅508 nm,日落黃482 nm,誘惑紅515 nm,酸性紅516 nm。

1.2.3 標準溶液的配制 濃度為0.500 mg/mL的酸性紅、誘惑紅標準溶液的配制:分別稱取按其純度折算為100%質(zhì)量的酸性紅、誘惑紅標準品0.0500 g,分別置于100 mL容量瓶中,用水溶解,并用水定容至刻度。

分別準確吸取1 mL檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和酸性紅母液于10 mL容量瓶中,用水定容至刻度,配制成濃度50 μg/mL混合標準儲備液,將混合標準儲備液分別稀釋為1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 μg/mL混合標準系列。檢測時,在上述色譜條件下進行測定,以標準系列溶液濃度為橫坐標(X)、相應的峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件的確定

2.1.1 蛋白的沉淀 在大量的實驗過程中,發(fā)現(xiàn)當遇到蛋白質(zhì)、脂肪含量高,樣品基質(zhì)復雜的情況時,按照國家標準《肉制品 胭脂紅著色劑測定》(GB/T 9695.6-2008)提取色素步驟繁瑣,合成著色劑無法被聚酰胺粉完全吸附,在洗滌的時候色素也不能完全洗滌下來,造成色素損失。

在研究中使用沉淀劑來沉淀蛋白質(zhì),但是在加入沉淀劑后,可以發(fā)現(xiàn)沉淀物上有顏色沉著。而且離心后也會出現(xiàn)絮狀物漂浮,在經(jīng)過水浴蒸干時,有大量的沉淀物,無法過柱,如果經(jīng)過離心再過柱，肉眼只能看見少量色素富集在沉淀物上。在實驗過程中比對加入沉淀劑和不加沉淀劑的回收率(詳見表1),結(jié)果表明,使用沉淀劑的回收率低于不加沉淀劑的。所以可以確定在使用沉淀劑沉淀蛋白的同時,也有一部分色素隨之沉淀。

表1 加沉淀劑和不加沉淀劑回收率比對表(n=6)Table 1 Recoveries of added precipitant and without precipitant(n=6)

表2 一次提取和二次提取回收率比對表(n=6)Table 2 Recoveries of single extraction and twice extraction(n=6)

2.1.2 提取次數(shù) 在第一次使用乙醇氨溶液提取色素后,提取液水浴蒸至5 mL左右,大量的蛋白質(zhì)經(jīng)過高溫后變性產(chǎn)生沉淀,如果直接用水定容需要離心后才能用0.45 μm濾膜過濾,實驗過程中發(fā)現(xiàn)這些沉淀吸附色素能力強,經(jīng)過離心后色素沉著嚴重,特別是對含量不超過1 mg/kg的樣品的影響較大。所以本方法采取二次使用乙醇氨溶液提取,由于合成色素易溶于乙醇氨溶液中,離心后色素不會隨著變性的蛋白質(zhì)沉淀,這樣大大提高了回收率(見表2)。

2.1.3 濃縮條件 在水浴揮干乙醇-氨溶液時,水浴溫度要控制在90 ℃以下,并且揮發(fā)至2 mL左右即可,如果水溫過高或蒸至太干,會影響其回收率,酸性紅甚至會出現(xiàn)檢測不出的情況,與文獻[17]的報道一致。

2.2 測定條件選擇

2.2.1 檢測波長的選擇 按照《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》(GB 5009.35-2016)測定合成色素采用254 nm檢測波長,在此波長下,有吸收的化學成分太多[18],測定時容易受樣品中其他成分干擾,峰重疊現(xiàn)象嚴重,無法明顯分離,特別是對于一些成分復雜的樣品,樣品中的其他雜質(zhì)與目標物質(zhì)分不開。6種色素選擇不同波長檢測,色譜峰分離效果明顯(見圖1),相互干擾現(xiàn)象大大降低。

2.2.2 流動相條件的選擇 文獻[19]證實在甲醇中加入適量的乙腈作為流動相能夠有效地提高色譜峰的對稱性,本研究發(fā)現(xiàn)單獨使用乙腈也可以很好得分離檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和酸性紅這六種色素。采用0.02 mol/L乙酸銨-乙腈溶液作為流動相,為了利于色譜峰的分離,多次對流動相的比例進行調(diào)整,后來發(fā)現(xiàn)乙酸銨和乙腈在流動相中比例的變化可以提高分離效果,故采用梯度洗脫條件,6種色素得到較好的分離,并能得到理想的色譜圖(見圖1)。

2.3 干擾物質(zhì)的排除

本方法雖然采取不同波長對6種色素分別進行檢測,避開大部分干擾物質(zhì)的吸收,但是肉制品樣品本身環(huán)境十分復雜,除含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)成分外,一些經(jīng)過加工處理的樣品,如牛肉條、豬肉條等小吃類的肉制品,由于添加物質(zhì)多,樣品處理后雜質(zhì)也較多,檢測樣品時,出現(xiàn)的可能是雜質(zhì)峰,可用6種色素的特征光譜進行確認。核查該物質(zhì)的光譜時,與相應對照品光譜比對,如光譜一致,則確認檢出目標色素,反之則可以排除。樣品加標和空白樣品按照1.2.1方法進行前處理、標準溶液按照1.2.3方法配制,后于1.2.2條件下檢測,6種人工合成色素保留時間重現(xiàn)性好,樣品處理后無明顯干擾,其標準溶液、樣品加標和空白樣品的色譜圖見圖1～圖3。

圖1 濃度為10 μg/mL的混合標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of 10 μg/mL mixed standard solution

圖2 空白樣品添加10 μg/mL混合標準色素的標準溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank sample added with concentration of 10 μg/mL mixed standard solution

2.4 標準曲線及檢出限

將混合標準系列溶液在1.2.2色譜條件下進行分析,以混合標準系列溶液濃度為橫坐標(X),相應的峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸?；貧w方程、相關系數(shù)及線性范圍、方法的檢出限(按3倍信噪比計算)見表3。

表3 線性范圍、標準曲線回歸方程、相關系數(shù)及檢出限Table 3 Standard curve of regression equation,correlation coefficient and linearity ranges

圖3 空白樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of blank sample

2.5 回收率及精密度

分別稱取10 g(精確至0.01 g)經(jīng)過絞碎混勻的肉制品共20份,加入混合標準溶液,添加量相當于1、2、10 mg/kg的平行樣品各6份,其中2份不加標準溶液作為本底樣品,按照方法1.2.2進行測定,檢測本底樣品不含6種色素。經(jīng)計算,檸檬黃的回收率為87.19%～90.86%、莧菜紅的回收率為70.33%～78.93%、胭脂紅的回收率為80.47%～88.43%、日落黃的回收率為86.98%～90.32%、誘惑紅的回收率為86.24%～93.08%、酸性紅的回收率為72.03%～79.53%。樣品的平均回收率、相對標準偏差結(jié)果見表4。

表4 回收率、精密度實驗結(jié)果(n=6)Table 4 Result of recovery and precision(n=6)

2.6 樣品的測定

按照本實驗方法測定了從大型超市抽取的86個樣品和從農(nóng)貿(mào)市場抽取的44個熟食樣品,抽取的這些樣品包含了叉燒、鹽焗雞、燒鴨、鹵雞爪、臘腸、臘肉、鹵豬腳、鹵鴨脖、火腿、牛肉干和豬肉干等。結(jié)果顯示大型超市的檢出率比較低,僅有2個樣品檢出,其中一個檢出酸性紅,另一個檢出檸檬黃。農(nóng)貿(mào)市場檢出率比較高,44個樣品中共有15個樣品檢出添加有1種或幾種色素,主要是檸檬黃、胭脂紅、日落黃和誘惑紅,檢出率為34%,有的色素添加濃度甚至高達300 mg/kg。本課題還從市場抽取了25個生鮮類樣品,包括雞肉、牛肉、豬肉,按照此方法進行檢測,均未檢出添加色素。

3 結(jié)論

本方法不需吸附、過濾、解析等步驟,前處理操作便捷、快速,能在較短時間內(nèi)實現(xiàn)對檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和酸性紅6種合成色素的檢測,有較好的回收率和精密度,加標回收率為70.33%～93.08%,檢出限為0.12～0.21 mg/kg,相對標準偏差均小于5%,表明該方法檢測結(jié)果準確、可靠,為肉制品中違法或超量添加各種色素的監(jiān)督檢驗提供了科學的方法,具有很好的實際應用價值。

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