摘 要：利用加速溶劑萃取-高效液相色譜-熒光檢測(cè)（accelerated solvent extractor-high performance liquid chromategraphy-fluorescent detection，ASE-HPLC-FLD）技術(shù)，建立快速同時(shí)檢測(cè)哈爾濱紅腸中4 種多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）的定量分析方法。采用優(yōu)化后的ASE和HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：苯并（a）芘（benzo（a）pyrene，B（a）P）、苯并（a）蒽（benzo（a）anthracene，

B（a）A）、?（chrysene，CHR）和苯并（b）熒蒽（benzo（b）fluoranthene，B（b）F）4 種PAHs的校正曲線線性關(guān)系良好，R2>0.999 0；B（a）A、CHR、B（b）F和B（a）P的方法檢出限分別為1.016、1.872、0.428、

0.104 μg/kg；加標(biāo)回收率均在50%～90%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8%；5 種哈爾濱紅腸中PAHs的總含量均遠(yuǎn)低于歐盟標(biāo)準(zhǔn)（30 μg/kg）。本方法可以同時(shí)檢測(cè)哈爾濱紅腸中的4 種PAHs，且靈敏度和準(zhǔn)確度較高、重現(xiàn)性好、易操作，適用于哈爾濱紅腸中PAHs的日?？焖贉y(cè)定與分析。

關(guān)鍵詞：哈爾濱紅腸；多環(huán)芳烴；高效液相色譜；熒光檢測(cè)

Abstract： A quantitative analysis method for four polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） in Harbin red sausage was established by accelerated solvent extraction coupled with high performance liquid chromatography with fluorescence detection

（ASE-HPLC-FLD）. The extraction and chromatographic conditions were optimized and the quantification was carried out by the external standard method. The results showed that the calibration curves for all four PAHs， benzo （a） anthracene

（B（a）A）， chrysene （CHR）， benzo（b） fluoranthene （B（b）F）， benzo （a） pyrene （B（a）P）， were linear with correlation coefficient （R2） greater than 0.999 0. The detection limits for the PAHs were 1.016， 1.872， 0.428 and 0.104 μg/kg， respectively. Overall recoveries from spiked samples were between 50% and 90% with relative standard deviation （RSD） below 8%. All the PAHs were detected simultaneously， sensitively， conveniently and accurately with high reproducibility by this method， making it useful for rapid determination of PAHs in Harbin red sausages.

Key words： Harbin red sausage； polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs）； high performance liquid chromatography （HPLC）； fluorescence detection

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201712007

中圖分類(lèi)號(hào)：R155.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2017）12-0036-05

引文格式：

李聰， 趙穎， 徐寶才， 等. 加速溶劑萃取-高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定哈爾濱紅腸中的4 種多環(huán)芳烴[J]. 肉類(lèi)研究， 2017， 31（12）： 36-40. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201712007. http：//www.rlyj.pub

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哈爾濱紅腸是我國(guó)東北地區(qū)的傳統(tǒng)肉制品，憑借其蒜香襲人、煙熏味適當(dāng)、肥而不膩的“三大法寶”深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。但作為一種傳統(tǒng)的煙熏肉制品，哈爾濱紅腸會(huì)在生產(chǎn)過(guò)程中由于環(huán)境、加工方式和包裝方式等原因受到多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）污染[2-4]。endprint

PAHs是一類(lèi)含有2 個(gè)及2 個(gè)以上苯環(huán)、對(duì)環(huán)境和食品均可造成強(qiáng)烈污染的環(huán)狀化合物[5]。PAHs具有脂溶性，且極難降解，會(huì)在人體中富集，同時(shí)具有強(qiáng)烈的致癌性和致突變性，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[2，6-9]。作為PAHs的一種，苯并（a）芘（benzo（a）pyrene，B（a）P）占全部致癌性PAHs的1%～20%，具有致癌性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、檢測(cè)方法靈敏，且與其他PAHs有一定相關(guān)性等特點(diǎn)，常被用作指標(biāo)化合物[10-13]。2012年，我國(guó)在強(qiáng)制性食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中規(guī)定熏、烤、燒類(lèi)肉制品中的B（a）P限量為5 μg/kg；

而歐盟2011年規(guī)定了食品中PAHs污染的另一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)為苯并（a）蒽（benzo（a）anthracene，B（a）A）、

?（chrysene，CHR）、苯并（b）熒蒽（benzo（b）fluoranthene，B（b）F）以及B（a）P的總含量，同時(shí)規(guī)定了熏肉制品中上述4 種PAHs的總殘留限量為

30 μg/kg[14]。相較于歐盟以4 種PAHs的總含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，我國(guó)單純以B（a）P的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)得出的結(jié)果較為片面。因此，建立能夠快速同時(shí)測(cè)定4 種PAHs含量的方法具有重要意義。

目前，可以通過(guò)高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[15]、氣相色譜（gas chromatography，GC）法[16]、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-mass spectrometry，GC-MS）法[17-18]、毛細(xì)管電泳法[19]、二階激光質(zhì)譜法[20]和酶聯(lián)免疫分析法[21]對(duì)PAHs進(jìn)行檢測(cè)。HPLC具有操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、定量精確等特點(diǎn)，已有許多研究采用HPLC結(jié)合熒光檢測(cè)器測(cè)定食物中PAHs的含量[22-28]，但采用國(guó)標(biāo)方法提取肉制品中的PAHs需要耗費(fèi)大量溶劑和人力，加速溶劑萃?。╝ccelerated solvent extraction，ASE）技術(shù)可以有效減少樣品的前處理時(shí)間，提高萃取效率，例如，Wang等[29]采用ASE-GC-MS法測(cè)定煙熏食品中殘留的16 種PAHs，Suranová等[30]采用ASE法建立了符合歐盟標(biāo)準(zhǔn)的熏肉中PAHs的測(cè)定方法。本研究采用ASE技術(shù)對(duì)哈爾濱紅腸樣品進(jìn)行前處理，采用HPLC儀結(jié)合熒光檢測(cè)器建立樣品中4 種PAHs的測(cè)定方法，同時(shí)為我國(guó)煙熏肉制品中4 種PAHs的檢測(cè)提供思路，使得我國(guó)的PAHs檢測(cè)能夠盡早與歐盟等國(guó)家接軌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 種哈爾濱紅腸樣品均為市售。

環(huán)己烷、甲醇、乙腈、硅膠 美國(guó)Fluka公司；

聚丙烯酸鈉 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；B（a）A、CHR、B（b）F標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Supelco公司；B（a）P標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司。HPLC儀用水均為超純水，所用試劑均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

ASE-350加速溶劑萃取儀（配備22 mL萃取池） 美國(guó)Thermo公司；Waters alliance E2695高效液相色譜儀（配備2475熒光檢測(cè)器） 美國(guó)Agilent公司；3K15高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；G-560E渦旋混勻器

美國(guó)Scientific Industries公司；Heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀

美國(guó)Tedia公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

精確稱(chēng)取1.000 0 g肉糜樣品，加入等質(zhì)量的聚丙烯酸鈉，攪拌均勻。將5 g活化后的硅膠、混勻后的肉糜樣品以及硅藻土依次裝填入萃取池中，擰緊池帽。ASE條件：萃取溫度100 ℃，加熱時(shí)間5 min，沖洗體積50%，靜態(tài)萃取時(shí)間6 min，循環(huán)3 次，吹掃時(shí)間120 s。萃取結(jié)束后，將萃取液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，55 ℃條件下旋轉(zhuǎn)濃縮至溶劑蒸發(fā)完全，用一定量的甲醇溶解，室溫下

10 000 r/min離心5 min；將上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，棄初濾液，取1 mL加入進(jìn)樣瓶，待上機(jī)測(cè)定。

1.3.2 HPLC條件

通過(guò)對(duì)SunFire TM-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Zorbax Eclipse PAH色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）的分離效果進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)SunFire TM-C18色譜柱無(wú)法對(duì)B（a）A和CHR進(jìn)行有效分離，采用PAHs分離專(zhuān)用柱Zorbax Eclipse PAH色譜柱時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)4 種PAHs的分離，且峰型較好。對(duì)Zorbax Eclipse PAH色譜柱的流動(dòng)相、柱溫、進(jìn)樣量以及流速進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳色譜條件。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制4 種PAHs的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，確保每種PAHs的質(zhì)量濃度均為150 ng/mL；準(zhǔn)確吸取2 mL上述工作液于10 mL棕色瓶中，用甲醇定容，并充分混勻，梯度稀釋至各PAHs的質(zhì)量濃度分別為30.0、15.0、7.5、2.5、1.0、0.5 ng/mL。分別吸取混勻后的溶液1 mL至進(jìn)樣瓶中，采用優(yōu)化好的HPLC條件進(jìn)行測(cè)定，并分別以4 種PAHs的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 加標(biāo)回收率的計(jì)算

精確稱(chēng)取1.000 0 g肉糜樣品2 份，向其中1 份中加入不同體積的PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其質(zhì)量濃度分別為15.0、2.5、1.0 μg/kg。按照1.3.1節(jié)的方法進(jìn)行前處理后，進(jìn)行HPLC測(cè)定。按照公式（1）計(jì)算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析endprint

2.1 4 種PAHs的萃取

ASE法在高溫和高壓條件下進(jìn)行，溫度升高，溶劑穿透力增強(qiáng)，且表面張力下降，能夠加快化合物從基體解吸進(jìn)入溶劑的速率；加壓使溶劑保持液態(tài)，采用少量溶劑即可快速提取固體樣品中的化合物。萃取溫度和時(shí)間是影響回收率的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)證明，萃取溫度100 ℃、加熱時(shí)間5 min、沖洗體積50%、靜態(tài)萃取時(shí)間6 min、循環(huán)3 次、吹掃時(shí)間120 s時(shí)的回收率最高。與傳統(tǒng)的勻漿提取或超聲波提取相比，采用ASE法萃取時(shí)，每個(gè)樣品只需20 mL溶劑萃取10 min即可，且萃取過(guò)程全部自動(dòng)化，不但節(jié)省溶劑，而且操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力。

2.2 HPLC條件的確定

對(duì)Zorbax Eclipse PAH色譜柱的流動(dòng)相、柱溫、進(jìn)樣量以及流速進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳色譜條件。初始流動(dòng)相為乙腈∶水=38∶62（V/V），梯度洗脫程序如表1所示，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL，進(jìn)樣流速2 mL/min。根據(jù)4 種PAHs的特性，設(shè)置熒光檢測(cè)程序如表2所示。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和方法檢出限

各PAHs的質(zhì)量濃度均為30 ng/mL時(shí)，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC圖如圖1所示。

由表3可知，各PAHs的質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系良好，R2均大于0.999 0，B（a）A、CHR、B（b）F和B（a）P的方法檢出限分別為1.016、1.872、0.428、0.104 μg/kg；按照3 倍信噪比（RS/N）計(jì)算得到的儀器檢出限為0.020 μg/kg。本方法的線性范圍較寬，但實(shí)際樣品中PAHs的含量差別較大，可以根據(jù)實(shí)際情況選取工作曲線的線性范圍。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

由表4可知，在3 個(gè)加標(biāo)水平下，4 種PAHs的平均回收率均在50%～90%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8%，表明采用ASE法能同時(shí)對(duì)紅腸中4 種PAHs進(jìn)行有效萃取，且檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度較高。

2.5 哈爾濱紅腸樣品的測(cè)定

采用本研究所建立的方法測(cè)定5 種市售哈爾濱紅腸中PAHs的含量，將5 種產(chǎn)品分別編號(hào)為QL、HJ、HJZ、LDF和DTF。5 種產(chǎn)品的HPLC圖如圖2所示。

由表5可知，5 種哈爾濱紅腸中B（a）P的含量均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（5 μg/kg），4 種PAHs的總含量均低于歐盟標(biāo)準(zhǔn)（30 μg/kg）。

3 結(jié) 論

本研究采用ASE法對(duì)哈爾濱紅腸中的PAHs進(jìn)行提取，并對(duì)提取液進(jìn)行濃縮、凈化后，采用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，4 種PAHs的線性關(guān)系良好，R2>0.999 0；3 種濃度下的加標(biāo)回收率為50%～90%；所測(cè)5 種哈爾濱紅腸樣品中4 種PAHs的總含量均低于歐盟標(biāo)準(zhǔn)（30 μg/kg），B（a）P含量均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（5 μg/kg）。本方法操作簡(jiǎn)便、提取效率高、重現(xiàn)性好、回收率較高，可以作為測(cè)定哈爾濱紅腸中4 種PAHs的一種方法。

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