耿長輝 張春玲 曹珍珍 衣洪天 何苗 黃樹民 菅晶晶 高萍

結(jié)腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率高，隨著手術(shù)、化療、分子靶向治療的發(fā)展，結(jié)腸癌患者近期生存質(zhì)量得到一定程度改善，但5年遠(yuǎn)期生存率仍不理想［1］。轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路在結(jié)腸癌病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，Sirtuin蛋白屬NAD＋依賴性組蛋白去乙?；?，既往報(bào)道證實(shí)Sirtuin蛋白可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路，參與腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)、細(xì)胞增殖及凋亡過程［2］。去乙酰化酶（Sirtuin6，SIRT6）是Sirtuin蛋白的重要成員，有研究顯示SIRT6蛋白與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但有關(guān)其在結(jié)腸癌中的報(bào)道尚屬少見［3］。本研究納入60例結(jié)腸癌患者作為研究對(duì)象，分析SIRT6表達(dá)與結(jié)腸癌病理特征的相關(guān)性，并對(duì)其可能的機(jī)制做初步探討，為臨床分子靶向治療提供參考。報(bào)道如下。

資料與方法

一、一般資料

納入2015年4月至2017年4月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院普外科60例結(jié)腸癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均經(jīng)組織病理活檢和結(jié)腸癌根治術(shù)確診；（2）入院前未接受放化療、內(nèi)分泌、手術(shù)干預(yù)及其他治療；（3）均獲得患者同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病歷資料缺失者；（2）合并有其他惡性腫瘤者。60例患者中男32例，女28例；平均年齡（54.31±12.86）歲；腫瘤位置：乙狀結(jié)腸17例，降結(jié)腸27例，升結(jié)腸16例；腫瘤直徑（4.27±1.82）cm；分期Ⅰ期17例，Ⅱ期28例，Ⅲ期15例；高分化16例，中分化25例，低分化19例。

二、研究方法

1.Western blot法檢測(cè) SIRT6和HIF-1α：（1）設(shè)備試劑：顯微鏡為日本Olympus公司提供的SZ51/SZ61型光學(xué)顯微鏡，MK3酶標(biāo)儀由上海賽摩科技生物發(fā)展有限公司提供。考馬斯亮蘭蛋白試劑盒由上海斯信生物科技有限公司提供，兔抗人SIRT6和缺 氧 誘 導(dǎo) 因 子 1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）多克隆抗體均由英國Abcam公司提供，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒由北京科宇深藍(lán)科技有限公司提供；（2）標(biāo)本采集：均取手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織和癌旁組織標(biāo)本，癌旁組織標(biāo)本應(yīng)距病灶邊界5 cm以上，將標(biāo)本浸泡于10%甲醛溶液12 h后，石蠟包埋切片，4 ℃保存；（3）檢測(cè)方法：取0.3 cm3樣本，以1：5比例依次加入適量Trizol試劑和氯仿。離心后取上層含RNA的水相層，再次離心，去上清液，室溫下風(fēng)干，于-80 ℃保存。采用考馬斯亮蘭蛋白試劑盒，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。根據(jù)蛋白分子量大小配制聚丙烯酰胺分離膠和基層膠，加入適量Marker蛋白，給予80 V/h電泳電壓，待樣品溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電泳增至110 V/h，當(dāng)溴酚藍(lán)的藍(lán)色至分離膠底部時(shí)，結(jié)束電泳。參照跑膠大小，對(duì)濾紙和聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜進(jìn)行裁剪，并將PVDF膜和濾紙浸泡于緩沖液中，將凝膠、PVDF膜置于濾紙間，使各層間無氣泡，在65 V/h電流條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)，2 h后停止。將PVDF膜封閉于5%牛奶封閉液中，孵育1 h后去封閉液，洗滌。將洗滌后的PVDF膜移至一抗溶液，4 ℃孵育過夜。去孵育抗體，用TBST漂洗液洗滌濾膜3次，5～10 min/次。取洗滌后的PVDF膜，再次進(jìn)行二抗，操作同上。完成后將PDVF膜置于ECL中，曝光顯影。

2.免疫組化法檢測(cè)SIRT6：取結(jié)腸癌組織石蠟切片，依次取二甲苯、無水乙醇、乙醇及PBS溶液進(jìn)行脫蠟處理，用3% H2O2滅活內(nèi)源性氧化酶后，取出切片，再用PBS溶液洗滌3次，5 min/次，采用微波修復(fù)法修復(fù)抗原，將切片移至枸櫞酸鈉緩沖液中，微波加熱至沸騰后冷卻，重復(fù)1次后用PBS洗滌，取切片，封閉10 min。在切片組織中加一抗，4 ℃條件下孵育12 h，洗滌取出后加入二抗，4 ℃下孵育20 min，洗滌后在切片上加適量二氨基聯(lián)苯胺顯色液，在顯微鏡下取高倍視野（×200）觀察切片組織顏色。

三、觀察指標(biāo)

根據(jù)Western blot法檢測(cè)結(jié)果記錄結(jié)腸癌組織和癌旁組織中SIRT6和HIF-1α蛋白表達(dá)水平，入院時(shí)收集患者性別、年齡基本病例資料，根據(jù)手術(shù)結(jié)果納入腫瘤位置、直徑、TNM分期及分化程度等病理資料，分析SIRT6和病理特征、HIF-1α的關(guān)系。根據(jù)免疫組化顯色結(jié)果判斷SIRT6蛋白性質(zhì)［4］，定位于細(xì)胞核，陰性：視野內(nèi)棕黃色腫瘤細(xì)胞＜20%，陽性：視野內(nèi)棕黃色腫瘤細(xì)胞≥20%。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)，多因素采用Logistic分析，相關(guān)性采用直線線性回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Western blot法檢測(cè)SIRT6蛋白和HIF-1α表達(dá)情況

結(jié)腸癌組織中SIRT6和HIF-1α分別為（1.87±0.65）和（1.72±0.59），癌旁組織中SIRT6和HIF-1α分別為（2.34±1.13）和（0.84±0.36），兩組間比較差異顯著（t=2.793，9.862；P=0.006，0.000）。見圖 1～4。

二、不同病理特征患者SIRT6蛋白表達(dá)差異

60例患者結(jié)腸癌組織經(jīng)免疫組化檢測(cè)SIRT6蛋白陽性13例，陰性47例，SIRT6不同表達(dá)水平患者間腫瘤分期和分化程度差異顯著（χ2=7.651，9.346；P=0.022，0.009）。見表 1，圖 5～6。

三、SIRT6蛋白表達(dá)多因素分析

將差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)賦值并納入多因素分析模型，賦值如下：分期（Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ期=2），分化（高分化=0，中分化=1，低分化=2）。經(jīng)多因素分析顯示腫瘤分期是影響SIRT6蛋白表達(dá)水平的獨(dú)立因素（P＜0.05）。見表2。

四、Western blot法檢測(cè)SIRT6和HIF-1α蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

結(jié)腸癌患者癌組織中SIRT6蛋白表達(dá)與HIF-1α水平呈顯著負(fù)相關(guān)性（r=-0.819，P=0.000），見圖7。

圖1 Western blot法檢測(cè)SIRT6/β-action 圖2 Western blot法檢測(cè)HIF-1α/β-action 圖3 SIRT6在結(jié)腸癌和癌旁組織中表達(dá) 圖4 HIF-1α在結(jié)腸癌和癌旁組織中表達(dá)

表1 不同病理特征患者SIRT6表達(dá)差異（例，%）

討 論

國內(nèi)有報(bào)道顯示結(jié)腸癌發(fā)病率居惡性腫瘤第4位，且呈年輕化趨勢(shì)［5］，既往報(bào)道顯示癌胚抗原、癌抗原125、基質(zhì)金屬蛋白酶-2及磷脂酰肌醇激酶-3等分子標(biāo)志物與結(jié)腸癌關(guān)系密切，但上述標(biāo)志物缺乏特異性，均不能用于指導(dǎo)結(jié)腸癌分子靶向治療［6-8］。SIRT6是Sirtuin蛋白的重要成員，具有去乙酰環(huán)酶和ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性作用，可與抑癌因子泛素特異性蛋白酶10協(xié)同作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖分化，對(duì)腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)、DNA修復(fù)及生產(chǎn)代謝過程均具有重要的調(diào)節(jié)作用［9-11］。

圖5 SIRT6在結(jié)腸癌組織中陰性表達(dá)（×10）圖6 SIRT6在結(jié)腸癌癌旁組織中陽性表達(dá)（×10）

表2 SIRT6蛋白表達(dá)多因素分析

圖7 SIRT6和HIF-1α相關(guān)性分析

本研究采用Western blot法檢測(cè)結(jié)腸癌和癌旁組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌組織中SIRT6蛋白表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織，提示結(jié)腸組織中SIRT6蛋白表達(dá)水平降低可能存在癌變風(fēng)險(xiǎn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示敲除SIRT6蛋白后小鼠腫瘤數(shù)量和大小增加，侵襲性增強(qiáng)［12］，提示SIRT6蛋白對(duì)結(jié)腸癌進(jìn)展可能存在保護(hù)作用，說明SIRT6蛋白在結(jié)腸癌病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。為此，本研究采用免疫組化法調(diào)查結(jié)腸癌患者SIRT6蛋白性質(zhì)，分析SIRT6蛋白和結(jié)腸癌病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌TNM分期是影響SIRT6蛋白表達(dá)水平的獨(dú)立因素，提示隨著腫瘤分期的進(jìn)展和浸潤深度的惡化，SIRT6蛋白表達(dá)被抑制，齊佳等［13］還認(rèn)為SIRT6蛋白在結(jié)腸癌基因轉(zhuǎn)錄階段便出現(xiàn)缺失，提示SIRT6蛋白不僅參與結(jié)腸癌病理進(jìn)程，其表達(dá)缺失還可能作為結(jié)腸癌變的標(biāo)記物，但這有待進(jìn)一步大樣本證實(shí)。另外，糖酵解能力增強(qiáng)是結(jié)腸癌患者典型的能量代謝特點(diǎn)［14］，SIRT6高表達(dá)能降低皮下脂肪和甘油三酯含量，糾正葡萄糖和胰島素水平，改善代謝障礙狀態(tài)。蒲詩云等［15］研究也認(rèn)為SIRT6能促進(jìn)氧化磷酸化，這對(duì)延緩腫瘤進(jìn)展具有重要意義，與本文結(jié)論一致。

HIF-1α是細(xì)胞代謝過程中重要的調(diào)控因子，與HIF-1β形成復(fù)合物，參與相關(guān)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄活化，A Prigione等［16］研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α能上調(diào)己糖激酶2和丙酮酸脫氫酶激酶-I表達(dá)水平，參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展。本研究也顯示SIRT6與HIF-1α具有顯著負(fù)相關(guān)性，說明SIRT6可通過調(diào)節(jié)HIF-1α表達(dá)，參與結(jié)腸癌病理進(jìn)展。另有報(bào)道顯示SIRT6能調(diào)節(jié)HIF-1α水平，進(jìn)而啟動(dòng)H3K9去乙?；?，下調(diào)其表達(dá)水平，抑制腫瘤細(xì)胞代謝途徑［17］，這可能是SIRT6發(fā)揮保護(hù)結(jié)腸癌進(jìn)展的作用機(jī)制之一。但臨床也有報(bào)道顯示SIRT6可能具有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用，提示SIRT6可能具有異質(zhì)性［18］，此外本研究樣本量小，研究結(jié)果有待大樣本證實(shí)。

綜上，結(jié)腸癌SIRT6表達(dá)水平與患者臨床病理分期具有顯著相關(guān)性，SIRT6高表達(dá)有助于抑制腫瘤進(jìn)展，這可能與SIRT6蛋白調(diào)控HIF-1α水平有關(guān)。

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