葛 青，毛建衛(wèi)，吳良如，范 煜，方吉雷，孫雨欣

(1.浙江科技學院 生化學院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江 杭州 310023；2.國家林業(yè)局竹子研究開發(fā)中心，浙江 杭州 310012； 3.浙江省竹子高效加工重點實驗室，浙江 杭州 310012)

竹葉中富含黃酮、多糖[1]、葉綠素、特種氨基酸等多種生物活性物質。黃酮類化合物具有明顯的抗?jié)?、解痙、抗炎及降血脂等多種生物活性[2]。在食品、藥品、化妝品等產(chǎn)品中，許多黃酮類提取物已得到一定的利用[3]。目前，竹葉黃酮的提取方法主要以乙醇[4，5]、丙酮[6]等作為溶劑進行熱回流提取，該方法應用于工業(yè)化生產(chǎn)時，存在耗能較大、耗時較長，且步驟較繁瑣，增加二次污染的機會，增加企業(yè)生產(chǎn)成本，同時水溶性也比較差，降低了原本的活性等缺點。因此，在實際生產(chǎn)中，很多食品企業(yè)往往采用水作為萃取溶劑的水浸提法，其具有提取成本較低，但提取效率低。因此，尋找一條效率高、成本低、污染小的竹葉有效成分提取新工藝成為人們所關心的問題。本實驗采用正交試驗分析法，對超聲波輔助水提取竹葉總黃酮和固形物含量的工藝條件進行了優(yōu)化，為更好地開發(fā)利用我國豐富的竹葉資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡竹葉(采自浙江科技學院后山)；乙醇，硝酸鋁，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，蘆丁(標準品)，95%乙醇，無水乙醇，濃硫酸，無水乙醚，丙酮，苯酚，葡萄糖等，均為分析純。

1.2 主要儀器

循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；5500PC紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)；TP214電子天平(賽多利斯丹佛)；RE52旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器有限公司)；KQ-500E超聲波清洗器(上海科學儀器有限公司)；TD5KR冷凍高速離心機(長沙東旺試驗儀器公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海葉拓實業(yè)有限公司)；循環(huán)水式真空泵(杭州大衛(wèi)科技有限公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1竹葉黃酮的提取 將采回的竹葉洗凈，在60 ℃的恒溫干燥箱中烘干，然后粉碎，過60目篩，放入干燥器中備用。取適量的竹葉放入超聲波提取裝置中，按所設定的提取溫度、提取時間、超聲功率、料液比以及提取次數(shù)，加入適量的純凈水進行超聲提取。浸提結束后減壓抽濾，收集濾液，濃縮，測定黃酮含量和固形物含量。

1.3.2竹葉黃酮含量的測定 采用硝酸鋁比色法測定黃酮含量[7-8]。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of Rutin

1.4 試驗設計

1.4.1單因數(shù)實驗 以水作為溶劑提取總黃酮和固形物含量，研究不同提取時間(10 min、20 min、30 mim、40 min、50 min、60 min)提取溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40)頻率(30 kHz、40 kHz、50 kHz、70 kHz、70 kHz)提取次數(shù)(1、2、3、4)對其得率影響。采用硝酸鋁比色法測定黃酮含量，計算得率。

1.4.2正交實驗 在單因數(shù)實驗的基礎上，采用L9(34)正交表，以黃酮得率和固形物得率為參考指標，對超聲時間，料液比，頻率，提取次數(shù)4個主要因數(shù)做正交試驗。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的制作

試驗以蘆丁標準品作為對照，采用硝酸鋁比色法測定黃酮含量。以吸光度D(λ)為縱坐標，標準液濃度(mg·L-1)為橫坐標，繪制標準曲線，得到擬合方程y=0.0122x-0.0809，R2=0.9991。

2.2 單因數(shù)實驗

2.2.1超聲時間對固形物和總黃酮得率的影響 在料液比1∶20，提取溫度60 ℃，超聲頻率40 kHz的條件下，分別在超聲時間為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min的條件下提取1次，研究超聲時間對竹葉中固形物和總黃酮得率的影響。實驗結果見圖2。從圖2可知：在10～30 min內，隨著時間的增加，總黃酮和固形物的得率與提取時間呈正相關，但提取時間到30 min后，總黃酮得率增加緩慢，固形物得率到提取時間達到40 min后增加緩慢。因此，確定最佳提取時間為40 min。

2.2.2提取溫度對總黃酮和固形物得率的影響 在料液比1∶20，提取時間40 min，超聲頻率40 kHz的條件下，分別在提取溫度為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的條件下各提取1次，研究提取溫度對竹葉中固形物和總黃酮得率的影響。實驗結果見圖3。從圖3可知：隨著溫度的升高，提取液中總黃酮含量和固形物的含量不斷增加，但到70 ℃后，固形物得率不在增加，總黃酮得率增加緩慢，考慮到提取溫度越高，能耗越大，所以選選擇70 ℃為最佳提取溫度。

圖2 提取時間對固形物和總黃酮得率的影響Fig.2 The effect of extraction time on the yield of solid content and total flavones

圖3 提取溫度對固形物和總黃酮得率的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on the yield of solid content and total flavones

圖4 料液比對固形物和總黃酮得率的影響Fig.4 The effect of solid-liquid ratio on the yield of solid content and total flavones

2.2.3料液比對總黃酮和固形物得率的影響 在提取溫度70 ℃，超聲頻率40 kHz，超聲時間40 min的條件下，分別在料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40的條件下各提取1次，研究料液比對竹葉提取中固形物和總黃酮得率的影響，實驗結果見圖4。從圖4可知：固形物和總黃酮得率隨著料液比的增加而增加，尤其在料液比1∶10～1∶30時，固形物和總黃酮得率增加比較快，增加到1∶40時，增加趨勢有所減緩，考慮到其上升趨勢比較緩慢，后期濃縮等處理成本高，所以選1∶30為最佳料液比。

2.2.4超聲頻率對總黃酮和固形物得率的影響 在提取溫度70 ℃，料液比1∶20，超聲時間40 min的條件下，分別在超聲頻率為30 kHz、40 kHz、50 kHz、60 kHz、70 kHz的條件下各提取1次，研究超聲頻率對竹葉提取中固形物和總黃酮得率的影響，實驗結果見圖5。從圖5可知：隨著超聲頻率的增加，竹葉提取物中固形物含量和總黃酮得率不斷增加。超聲頻率超過50 kHz后，固形物和總黃酮得率增加減緩，所以選擇超聲頻率為50 kHz。

2.2.5提取次數(shù)對總黃酮和固形物得率的影響 在提取溫度70 ℃，料液比1∶20，超聲時間40 min，超聲頻率40 kHz的條件下，對比浸提次數(shù)對竹葉提取中固形物和總黃酮得率的影響，實驗結果見圖6。從圖6可知：隨著提取次數(shù)的增加，竹葉提取物中固形物含量和總黃酮得率不斷增加。到提取2次后固形物得率繼續(xù)增加，而黃酮得率基本不變?？紤]到時間和能耗成本，選2次為最佳提取次數(shù)。

圖5 超聲頻率對固形物和總黃酮得率的影響Fig.5 The effect of ultrasonic frequency on the yield of solid content and total flavones

圖6 提取次數(shù)對固形物和總黃酮得率的影響Fig.6 The effect of extraction times on the yield of solid content and total flavones

2.3 正交試驗

通過單因素試驗初步確定超聲輔助水提取竹葉中總黃酮和固形物的工藝條件為提取溫度70 ℃，提取時間40 min，料液比1∶30，提取次數(shù)2次，超聲頻率50 kHz。在單因數(shù)實驗的基礎上，采用L9(34)正交表，以總黃酮得率和固形物得率為參考指標，對超聲時間，料液比，頻率，提取次數(shù)等4個主要因數(shù)做正交試驗，每個試驗進行3次。正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因數(shù)水平表L9(34)

超聲波輔助水提取竹葉總黃酮得率正交實驗結果及極差分析見表2，數(shù)據(jù)處理采用直觀分析方法，以極差大小確定因素主次順序。從表2中極差分析可知：影響總黃酮得率的主要因素是超聲頻率，其次是料液比和超聲溫度，超聲時間對總黃酮得率的影響最小。總黃酮提取的最佳組合為A2B1C1D3，即提取時間40 min，料液比1∶20，超聲溫度70 ℃，超聲頻率40 kHz。

超聲波輔助水提取竹葉固形物得率正交實驗結果及極差分析見表3，數(shù)據(jù)處理采用直觀分析方法，以極差大小確定因素主次順序。從表3中極差分析可知，影響固形物得率的主要因素是超聲溫度，其次是超聲時間和超聲頻率，料液比對總黃酮得率的影響最小。固形物提取的最佳組合為A3B2C3D3，即提取時間50 min，料液比1∶40，超聲溫度70 ℃，超聲頻率50 kHz。

2.4 驗證試驗

在最佳條件下進行驗證試驗，平行實驗 3 次，測得總黃酮得率為1.23%，固形物得率為 13.15%，該結果大于單因素實驗最佳條件的得率。說明各因素間相互作用可以提高竹葉總黃酮和固形物得率，達到更好的提取效果。

表2 總黃酮正交試驗結果

表3 固形物正交試驗結果

4 結論

本實驗所采用超聲波輔助水提取淡竹葉總黃酮的最佳工藝條件為提取時間40 min，料液比1∶20，超聲溫度70 ℃，超聲頻率40 kHz。在此最佳工藝條件下總黃酮得率為1.23%。超聲波輔助提取固形物的最佳工藝條件：提取時間50 min，料液比1∶40，超聲溫度70 ℃，超聲頻率50 kHz。在此最佳工藝條件下固形物得率為 13.15%。本法(超聲波輔助水提取法)與傳統(tǒng)有機溶劑提取黃酮得率1.0%～1.3%相差不大，符合實驗預期，同時水是安全溶劑，具有提取條件溫和、操作簡便省時等優(yōu)點，適合大規(guī)模地推廣，更有利于保持黃酮的生物活性，從而為竹葉黃酮保健功效的研究和相關產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎。

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