佘 瑤 楊 陳 吳洪鑾 王淑君 潘慶軍 劉華鋒

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎臟疾病研究所，湛江524001)

急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)是指由多種病因引起的、以腎功能快速下降為主要特點的臨床綜合征，目前，AKI仍然是危重醫(yī)學(xué)科和腎病中血液透析的主要病因。腎小管上皮細(xì)胞的損傷以及死亡(凋亡和壞死為主)是AKI主要的病理變化。既往認(rèn)為凋亡是腎小管細(xì)胞主要死亡方式，但現(xiàn)發(fā)現(xiàn)多種死亡方式也參與其中，如necroptosis(程序性壞死)和細(xì)胞焦亡等[1,2]。其中，necroptosis是最受重視且進展最快的研究熱點，對其作用和機制的深入研究，有望為防治AKI提供新的治療靶點，本文就腎小管上皮細(xì)胞的necroptosis在AKI的研究新進展作一綜述。

1 Necroptosis的概念和特點

眾所周知，壞死長期被認(rèn)為是一種被動的細(xì)胞死亡方式，缺乏相關(guān)機制研究，且難以通過藥物干預(yù)得到減輕或逆轉(zhuǎn)。然而最近研究發(fā)現(xiàn)：部分類型的細(xì)胞壞死與凋亡過程類似，由特定的刺激信號啟動，并依賴于一定的信號傳導(dǎo)通路和執(zhí)行程序的發(fā)生，具有精密的調(diào)控機制。此類細(xì)胞壞死方式被命名“necroptosis”，即程序性壞死。

Necroptosis過程具有以下幾點特征：①具有壞死細(xì)胞死亡的形態(tài)(膜破裂、胞漿和細(xì)胞器腫脹、胞內(nèi)容物溢出[3])；②線粒體膜電位下降；③自噬是necroptosis的普遍下游應(yīng)答表現(xiàn)；④活性氧增加不是細(xì)胞死亡的主要介質(zhì)；⑤壞死過程能被小分子necrostatin-1抑制；⑥受到多種基因調(diào)控,是有規(guī)律的細(xì)胞死亡方式。

Necroptosis與經(jīng)典的凋亡有很大區(qū)別。①形態(tài)學(xué)上，凋亡細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)特征包括細(xì)胞皺縮、核固縮、染色質(zhì)濃聚、核DNA斷裂、凋亡小體形成等；而necroptosis不形成凋亡小體,染色質(zhì)不凝聚。②機制方面，凋亡主要包括兩條不同的信號傳導(dǎo)通路，即外源性信號傳導(dǎo)通路，由細(xì)胞膜上的死亡受體所介導(dǎo)而這些受體屬于腫瘤壞死因子受體(Tumor necrosis factor receptor，TNFR)家族比如Fas、TNFR1、TRAILR、FN14等。內(nèi)源性信號傳導(dǎo)通路并不依賴于死亡受體，其啟動信號是細(xì)胞色素C從線粒體膜間隙釋放的。而這兩條信號傳導(dǎo)途徑均需要caspase的活化及其誘發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)參與。而necroptosis的信號傳導(dǎo)則不依賴于caspase的活化，TNF-α介導(dǎo)的壞死也不需線粒體釋放細(xì)胞色素C[4]。③結(jié)局上，細(xì)胞發(fā)生necroptosis總是伴發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)，而細(xì)胞凋亡不引起周圍組織的炎癥反應(yīng)。

2 介導(dǎo)necroptosis的主要信號通路

2.1受體相互作用介導(dǎo)的necroptosis(Receptor interacting protein kinase(RIPK)-mediated necroptosis) 研究發(fā)現(xiàn)，necroptosis啟動信號源于死亡受體特別是腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)的活化。TNF與TNFR1結(jié)合后形成復(fù)合體Ⅰ，該復(fù)合體包括TNFR1、TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(TRADD)、受體相互作用蛋白-1(RIP1)、TNF受體相關(guān)因子2(TRAF2)以及細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑(cIAPs)。RIP1被去泛素化酶CYLD去泛素化脫離死亡受體,隨后與Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(Fas-associated protein via a death domain,FADD)及caspase-8形成復(fù)合體Ⅱ。

從復(fù)合體Ⅰ到復(fù)合體Ⅱ的轉(zhuǎn)變也代表著細(xì)胞從生存轉(zhuǎn)向死亡的變化。該轉(zhuǎn)化過程：去泛素化酶CYLD對RIP1的去泛素化，隨后RIP1和RIP3兩種蛋白質(zhì)中通過RHIM域相互作用組成壞死復(fù)合體-necrosome[5,6]。復(fù)合體Ⅱ形成后，若caspase-8并沒有被抑制，或者RIP3的表達量并不高，caspase-8剪切下游caspases，比如caspase-3/7從而引起細(xì)胞凋亡；同時通過剪切和鈍化RIP1、RIP3和CYLD[7,8]阻止necroptosis的執(zhí)行。若caspase-8的活性被藥物或者基因干預(yù)，或細(xì)胞高表達RIP3，則壞死性細(xì)胞死亡通路激活。在此時，RIP1和RIP3通過RHIM域相互作用結(jié)合在一起。RIP3隨后發(fā)生自體磷酸化，接著募集MLKL形成necrosome[9]，開始啟動necroptosis進程。

2.2線粒體介導(dǎo)的necroptosis(mitochondria-mediated necroptosis) 近年來研究發(fā)現(xiàn)，線粒體及其組分不僅參與細(xì)胞凋亡通路，還在necroptosis中扮演的重要角色。已知TNF-α 誘導(dǎo)的necroptosis需要RIP1和RIP3的活化以及MLKL的相互作用。最近，王曉東教授研究發(fā)現(xiàn)[10]，由RIP1和RIP3組成的、介導(dǎo)necroptosis的復(fù)合物中，有一個新組分為線粒體蛋白磷酸酶PGAM5。PGAM5呈現(xiàn)為兩種剪接變體，PGAM5L(長形)和PGAM5S(短形式)，任何一種形式的敲除PGAM5均能減少由TNF-α、活性氧(ROS)以及鈣離子超負(fù)荷等多種原因誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死，而RIP3和MLKL的敲除僅單一阻斷TNF-α介導(dǎo)的壞死。進一步研究發(fā)現(xiàn)，necroptosis有兩條信號途徑：①外部信號路徑是TNF-α誘導(dǎo)激活RIP1/RIP3/MLKL組成的necrosome復(fù)合體，隨后激活PGAM5和Drp1；②內(nèi)部信號可能是在t-butyl hydroxide(TBH-生成ROS)和A23187激活PGAM5和Drp1，并不依賴于RIP1/RIP3/MLKL組成的necrosome復(fù)合體。在壞死誘導(dǎo)后，PGAM5S募集線粒體裂變因子(Dynamin-related protein 1,Drp1)的絲氨酸637位點使其去磷酸化得以激活其GTP酶活性。Drp1激活導(dǎo)致線粒體碎片化，這是早期壞死執(zhí)行的必要步驟。因此，PGAM5被認(rèn)為是多種壞死途徑的中轉(zhuǎn)站。

雖然，PGAM5L和PGAM5S都參與necroptosis過程，但是二者還有一些區(qū)別。有意思的是，壞死抑制劑Necrosulfonamide可以抑制PGAM5S的磷酸化，進而抑制PGAM5S與RIP1/RIP3/MLKL/PGAM5L復(fù)合物的結(jié)合；但是Necrosulfonamide對PGAM5L的磷酸化無影響。在Necrosulfonamide作用下，PGAM5L仍與壞死體穩(wěn)定結(jié)合，通過激活Drp-1，接著向下傳遞壞死信號[10]。

此外，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變mPT(mitochondrial permeability transition)也參與介導(dǎo)necroptosis。mPT孔被認(rèn)為是由腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位子(一種電壓依賴性陰離子通道)和親環(huán)蛋白D(CypD，Ppif基因產(chǎn)物)組成[11]。在ROS和鈣離子超負(fù)荷刺激下，其與內(nèi)膜ANT結(jié)合，線粒體發(fā)生mPT,從而引起線粒體膜和線粒體功能受損，線粒體的膜電位迅速發(fā)生變化導(dǎo)致necroptosis。

2.3PARP介導(dǎo)的necroptosis[Poly(ADP-ribose)-polymerase 1(PARP1)-mediated necroptosis] 多核苷酸二磷酸-核糖聚合酶-1[Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP-1]位于細(xì)胞核，是一種caspase非依賴性死亡的關(guān)鍵因子,參與DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核酶[12]。PARP途徑介導(dǎo)的壞死是PARP1過度活化，參與DNA損傷(PARP-1可識別損傷的DNA片段)。DNA-烷化劑例如1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(MNNG)，導(dǎo)致PARP的大量合成，隨之發(fā)生NAD+和ATP的快速消耗。緊接著，在JNK、線粒體蛋白Bax和鈣蛋白酶/組織蛋白酶蛋白酶作用下凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)發(fā)生切割[13,14]，然后從線粒體轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)溶膠，并進一步轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中與組蛋白H2AX和親環(huán)蛋白A形成DNA降解復(fù)合物。該復(fù)合物誘導(dǎo)不依賴于caspase大規(guī)模的DNA斷裂并產(chǎn)生前饋信號循環(huán)引起necroptosis[15,16]。

3 AKI中腎小管上皮細(xì)胞的necroptosis

生理狀態(tài)下，necroptosis這種細(xì)胞死亡程序在防御細(xì)胞內(nèi)感染起到作用。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)necroptosis與神經(jīng)退行性病變、炎癥性疾病，如急性胰腺炎、缺血性疾病和肝腎損傷[17]等其他一些常見的臨床疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。其在腎臟疾病中的作用也逐漸得到報道。

Linkernann等[17]在動物模型中，首次確認(rèn)necroptosis參與缺血-再灌注所致腎臟損傷(IRI)。在IRI模型中使用necroptosis的特異性抑制劑necrostatin-1 (Nec-1)之后腎組織損害顯著改善,這也就支持在缺血性AKI發(fā)病機制中necroptosis扮演重要的角色[18]。重要的是,用凋亡的關(guān)鍵酶caspase抑制劑zVAD-fmk治療并沒有減輕腎臟的結(jié)構(gòu)損害，也沒有抑制IRI后誘導(dǎo)的血清肌酐或尿素升高,腎小管細(xì)胞壞死也沒有減少。

后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)necroptosis的蛋白(例如，RIPK1，RIPK3和/或MLKL表達和/或磷酸化水平增加)在各種腎臟疾病均活化上調(diào)(至少在小鼠模型中)，包括由IRI導(dǎo)致的AKI、尿石癥，順鉑誘導(dǎo)的AKI和單側(cè)腎切除術(shù)后的慢性腎病[19]。Nec-1幾乎在所有這些環(huán)境中具有腎保護作用，因此，necroptosis可能是上述腎病關(guān)鍵的發(fā)病機制之一。

3.1受體相互作用介導(dǎo)的necroptosis在AKI中作用 Caspase已受到抑制的腎小管上皮細(xì)胞(Tubular epithelial cells，TEC)在TNF-α刺激下觸發(fā)壞死，但是用nec-1抑制RIPK1或者敲除RIPK3的TEC發(fā)生壞死抑制[20]。Linkermann等[21]證明由受體相互作用蛋白激酶家族組合引起的壞死可能發(fā)生在培養(yǎng)的腎臟細(xì)胞中，表明受體相互作用介導(dǎo)的necroptosis也可能發(fā)生在腎臟內(nèi)。

Nec-1可抑制腎小管細(xì)胞死亡使其不發(fā)生順鉑誘導(dǎo)的非caspase依賴性壞死(CICD)并且恢復(fù)細(xì)胞生存能力[22]。RIP3敲除小鼠不僅沒有發(fā)生腎小管壞死，并且，減輕腎缺血再灌注和順鉑誘導(dǎo)AKI的腎損傷，具有明顯的腎保護作用[23]。

Ripk3-/-和Mlk1-/-小鼠與野生型相比更不容易發(fā)生草酸鹽晶體和順鉑誘導(dǎo)的AKI，相關(guān)的一些現(xiàn)象是其血漿肌酸酐水平降低，腎小管損傷和中性粒細(xì)胞浸潤較局限[24]。用Nec-1，sanglifehrin(Sf)A和16-86單獨或聯(lián)合使用在缺血再灌注模型[25]獲得類似的數(shù)據(jù)。

捐贈腎臟的B6老鼠caspase-8基因沉默，移植腎臟中壞死增加，以及增加高遷移率族蛋白B1釋放，當(dāng)腎臟移植到BALB/c患者時腎功能下降以及排斥加劇。用溴乙啡錠二聚體灌注評估體內(nèi)的壞死，RIP3敲除腎臟缺血后壞死顯著減少。腎移植接受者移植RIPK3陰性腎臟，移植腎的生存率更長并且腎功能與相比RIPK3陽性有提高。因此，RIPK3介導(dǎo)的壞死在捐贈者腎臟中可以促進炎癥損傷，并在腎缺血再灌注損傷和移植生存具有重大影響[20]。

抑制壞死在器官移植中可能對臨床具有益處，但目前有效的或具體的治療方法仍存在爭議。雖然干擾necroptosis具有治療的可能性，不幸的是，臨床的研究表明RIP1抑制劑Nec-1的治療效果并不令人滿意[26]，Nec-1對于RIP1酶活性的抑制不足以阻止疾病的進展或者necrostatin對于RIP1酶活性的抑制在某種程度上來說達不到臨床治療效果。

目前，除Nec-1以外，研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些干預(yù)受體相互作用介導(dǎo)的necroptosis通路的藥物。漢黃芩素以RIPK1/RIPK3依賴性方式起作用。在順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠模型使用漢黃芩素，體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，漢黃芩素顯著抑制血清肌酐和尿素氮(BUN)水平的升高，使其幾乎達到正常水平。PAS染色和KIM-1分析顯示漢黃芩素還減弱了腎小管損傷。

抑制RIP3活性能轉(zhuǎn)換necroptosis信號，達拉非尼是選擇性RIP3抑制劑[27]，帕唑帕尼片選擇性抑制RIP1，帕納替尼則是兩者都抑制[28]，但遺憾的是這三種藥物并未用于治療腎臟疾病。

A20是一種與多種人類疾病相關(guān)的抗炎癥蛋白。在necroptosis過程中Lys5與RIP3泛素化相關(guān)并能促進necrosome的形成，A20作用于此過程從而抑制necroptosis。A20缺陷小鼠如敲除RIP3其致死率減低[29]。

3.2線粒體介導(dǎo)的necroptosis在AKI中作用 關(guān)于mPT介導(dǎo)的necroptosis研究在AKI中較為深入。其中CypD被認(rèn)為是mPT重要的組成成分。CypD缺陷小鼠與野生型相比在ROS刺激下顯示壞死抵抗[30]。并且在H2O2刺激下CypD敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的死亡抵抗。這結(jié)果是與Nakagawa等[31]和Baines等[32]的研究是一致的，這也表明CypD在ROS和鈣離子超負(fù)荷刺激下能調(diào)節(jié)necroptosis。

在為期5 d缺血后CypD敲除小鼠與野生型小鼠相比評估腎功能的血漿肌酐和血尿素氮水平顯著降低。紅細(xì)胞捕獲,腎小管細(xì)胞壞死,腎小管擴張,中性粒細(xì)胞浸潤等病理現(xiàn)象在CypD敲除小鼠明顯減少。同時，CypD缺乏腎臟保護作用也被IRI的體外模型證實[33]。環(huán)孢菌素A可抑制CypD阻止氧化劑刺激近端小管細(xì)胞(PTC)線粒體膜去極化,減少LDH釋放,ATP耗竭和細(xì)胞壞死。同樣,CypD-PTC可使細(xì)胞免受氧化劑刺激細(xì)胞毒性和壞死。說明CypD基因敲除可能通過抑制mPT和ATP耗竭而減輕線粒體介導(dǎo)的necroptosis從而使腎臟免受IRI損傷。

免疫抑制劑藥物環(huán)孢霉素A(CsA)是一種鈣調(diào)磷酸抑制劑，是目前已知最有效的mPT抑制劑[34]。它特異性阻斷CypD與腺苷酸轉(zhuǎn)運體結(jié)合，有效抑制mPT開放，維持線粒體穩(wěn)定[35]。在大鼠缺血再灌注模型中，CsA阻止線粒體膜去極化,減少細(xì)胞壞死，減少腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷[36]。因此，干預(yù)CypD-mPT介導(dǎo)的necroptosis可能減輕AKI的發(fā)生發(fā)展。

3.3PARP介導(dǎo)的necroptosis在AKI中作用 在腎缺血再灌注模型中，與野生型小鼠相比，PARP-1敲除的小鼠其eGFR的下降顯著減輕，腎臟壞死細(xì)胞比例也是明顯減少[37]。而敲除PARP-1并不影響AKI小鼠腎臟凋亡細(xì)胞數(shù)量。不僅如此，較之野生型小鼠，PARP-1敲除的小鼠腎臟ATP水平在遭受缺血再灌注損傷后，并未明顯下降，仍與正常小鼠水平相似。有意思的是，敲除PARP-1也減弱腎纖維化和炎癥反應(yīng)。與腎缺血再灌注野生型小鼠相比，PARP-1敲除小鼠腎臟浸潤的中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著減少、炎癥分子水平顯著降低(免疫反應(yīng)減弱)。上述結(jié)果表明腎臟缺血再灌注中主要病理損害是壞死性細(xì)胞死亡，接著是免疫反應(yīng)。輸尿管梗阻模型實驗也證明PARP-1敲除小鼠保護細(xì)胞免受壞死，而不是干預(yù)凋亡[38]。

在未敲除PARP-1小鼠上使用PARP-1抑制劑PJ34發(fā)現(xiàn)其血清肌酐和尿素濃度降低[39]。有趣的是PARP-1抑制劑的作用已被證明有益于心臟移植[40]，在臨床前腎缺血再灌注模型和在臨床試驗中可能保護移植腎腎功能。

4 展望

綜上，necroptosis是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種不依賴于caspase的新型細(xì)胞死亡途徑，在腎臟疾病中的研究剛起步，可能在IRI導(dǎo)致的AKI、順鉑誘導(dǎo)的AKI，尿石癥、輸尿管梗阻及單側(cè)腎切除術(shù)后誘發(fā)的AKI等起關(guān)鍵的致病作用。目前AKI仍然是危重醫(yī)學(xué)科和腎病醫(yī)學(xué)科中血液透析的主要病因，腎小管上皮細(xì)胞的壞死是AKI的主要病理改變，necroptosis作為一個新興的研究領(lǐng)域，目前發(fā)現(xiàn)靶向抑制necroptosis發(fā)生過程中的一些關(guān)鍵分子RIPK1、RIPK3、CypD和PARP-1，有望預(yù)防AKI的發(fā)生及AKI向CKD進展，為AKI的防治提供新的策略。因此，進一步探討necroptosis相關(guān)通路在AKI中的作用，有利于明確AKI機制，并且對AKI的治療靶點確證以及治療藥物的研究具有重要意義。