王曉娟 答邦明 丁亞文 馮 剛

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430033)

非小細胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌類型的80%〔1〕。NSCLC的治療策略包括放療、化療及與最新發(fā)展的細胞治療、免疫療法和靶向藥物治療相結合。新的診療方法提高了NSCLC患者的生存率。但目前早期診斷的NSCLC患者5年生存率為40%～67%，進展期NSCLC患者中位生存期僅有2年〔2〕。多種腫瘤抑制基因的失活或某些致癌基因的超表達在肺癌發(fā)生發(fā)展中起重要調控作用，本研究初步探討微小RNA分子(miR)-126在體外對NSCLC細胞系A549細胞增殖、轉移和侵襲性的影響。

1 材料與方法

1.1實驗細胞 正常肺上皮細胞系16-HBE細胞和肺癌細胞系A549細胞購于 American Type Culture Collection(ATCC)，培養(yǎng)于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的 DMEM 完全培養(yǎng)基，每3 d換液1次。

1.2主要試劑和儀器 TRIzol購自Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco公司，MTT試劑盒購于sigma公司，逆轉錄試劑盒和SYBR Green qPCR Supermix購于全式金公司。miR-126 mimic、inhibitor及其陰性對照購于廣州銳博。

1.3實驗方法

1.3.1實時定量PCR 通過TRIzol提取細胞總RNA，20 ng總RNA逆轉錄用來合成cDNA。2.5 μl cDNA、1 μl miR-126特異性引物與SYBR Green qPCR Supermix混合后進行實時定量PCR測定。以小RNA分子U6為內參定量miR-126濃度。

1.3.2細胞活性檢測 A549細胞接種于96孔板，每孔200 μl培養(yǎng)基，接種3 000個細胞。細胞培養(yǎng)在37℃ 5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱24～72 h，之后每孔添加20 μl噻唑藍(MTT)。細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸取培養(yǎng)基后，每個孔添加150 μl二甲基亞砜(DMSO)10 min，搖動培養(yǎng)板促進結晶溶解均勻。酶標儀下，570 nm處檢測每個孔光學密度(OD)值。

1.3.3細胞劃痕試驗 A549細胞種于6孔板，垂直于水平軸在板底劃一條直線，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次洗掉浮起的細胞。添加無血清培養(yǎng)基后在37℃和5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。倒置顯微鏡下分別于0、24、48 h拍照。愈合率=(初始寬度-目前寬度)/初始劃痕寬度×100%。

1.3.4Transwell實驗 A549細胞轉染后用無血清培養(yǎng)基制成單細胞懸液。溶解的基底膜基質(30 μl)被添加到每個Transwell上層膜上，然后將小室插入24孔板。將細胞懸液加入小室中，培養(yǎng)24 h后刮去膜上層細胞，結晶紫染色膜下層細胞，顯微鏡下拍攝計數細胞侵襲數目。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0軟件進行方差分析及q檢驗。

2 結 果

2.1miR-126在A549細胞中的表達 A549細胞株中miR-126水平(0.27±0.05)明顯低于16-HBE細胞(1.00±0.26，P<0.01)。

2.2miR-126對A549細胞增殖能力的影響 MTT結果表明，與空白組(OD值：0.41±0.07)和對照組(0.43±0.05)相比，miR-126 mimic可明顯降低A549細胞的增殖率(0.27±0.02)，miR-126 inhibitor可明顯增加A549細胞的增殖率(0.61±0.08，P<0.01)。

2.3miR-126對A549細胞遷移的影響 細胞劃痕試驗結果顯示，miR-126 mimic組劃痕修復率(37.6%±6.9%)明顯低于對照組(52.3%±10.2%)和空白組(55.7%±94.0%，P<0.01)。miR-126 inhibitor組(69.7%±6.2%)明顯高于對照組和空白組(P<0.05)。

2.4miR-126對A549細胞侵襲性的影響 Transwell實驗結果顯示，miR-126 mimic組小室膜下細胞數目〔(216.5±31.2)個〕明顯低于對照組〔(411.0±41.7)個、(425.1±49.5)個，P<0.01〕。miR-126 inhibitor組〔(662.4±94.3)個〕明顯高于對照組和空白組(P<0.01)。

3 討 論

mRNA長度在18～25個核苷酸，通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR)不完全配對結合對靶基因起到負調控作用。mRNA在幾乎所有的生理學和病理生理學過程如細胞分化、增殖、凋亡及細胞周期中扮演一個至關重要的角色。在腫瘤中，多種mRNA表達異常，mRNA可能作為一個腫瘤抑制基因或致癌基因在腫瘤的生物學行為中起到關鍵調控作用〔3〕。miR-126是一個與內皮細胞功能相關的mRNA，其基因位于人類9號染色體表皮生長因子(VEGF)基因區(qū)域內〔4〕。在高度血管化的組織，包括心、肺、肝或人類臍靜脈內皮細胞中miR-126呈高水平表達，促進血管生成和維護血管完整性〔5〕。miR-126在多種腫瘤組織中表達明顯減少。本研究提示miR-126對肺癌的生物學行為可能有重要的調控作用。

miR-126在不同類型癌癥的具體作用仍存在爭議。腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲是腫瘤發(fā)展的主要幾種生物學行為，是影響惡性腫瘤患者預后的重要因素，受到多種基因調控。既往研究顯示，miR-126可通過下調VEGF-A的表達抑制食道癌的轉移〔6〕。miR-126還可通過抑制BCL2L2促進宮頸癌細胞的凋亡〔7〕。此外，miR-126還可通過不同的靶點對肝癌、慢性淋巴癌和腎細胞癌等多種惡性腫瘤起到抑制作用〔8～10〕。本研究結果表明，miR-126可明顯抑制A549細胞體外增殖、遷移和侵襲能力。

通過生物信息學手段可發(fā)現PIK3R2可能是miR-126的潛在靶基因。PIK3R2編碼的蛋白質是構成磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的重要組成部分，PI3K/絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路是一個重要的轉導通路，可以調節(jié)細胞增殖、凋亡和細胞周期〔11〕。既往研究顯示，miR-126可以通過調控PIK3R2對滑膜成纖維細胞增殖、膀胱癌細胞增殖和轉移起到調控作用〔12，13〕。miR-126可能通過靶向PIK3R2調控PI3K信號途徑對A549細胞體外增殖、遷移和侵襲能力起到抑制作用。

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