陳克克,強(qiáng) 毅

(1.西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院/基因工程實驗室,陜西 西安 710065;2.陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室,陜西 西安 710119)

北蒼術(shù)(Atractylodeschinensis(DC.) Koidz.)為菊科蒼術(shù)屬植物,主產(chǎn)于陜西、內(nèi)蒙古、河北、山西、河南、甘肅、吉林、遼寧、黑龍江等地[1-2],其干燥根莖入藥為蒼術(shù)(ATRACTYLODIS RHIZOMA)。蒼術(shù)為我國常用中藥材,具有降血壓、抗心律失常、抗腫瘤、抗?jié)儭⒖咕?、抗炎、利尿、保肝等作用[3-7],主要用于濕阻中焦、脘腹脹滿、泄瀉、水腫、腳氣痿蹙、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)寒感冒、眼目昏澀等癥。國內(nèi)、外關(guān)于蒼術(shù)化學(xué)成分的研究表明,蒼術(shù)含有揮發(fā)油、多糖、倍半萜類化合物、三萜類化合物、聚乙炔類化合物、類固醇、香豆素等活性成分[8-14],其中科研工作人員對蒼術(shù)揮發(fā)油開展了深入透徹的研究,分別從蒼術(shù)揮發(fā)油的分類鑒定、化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理作用等方面進(jìn)行了分析評價。目前，尚未見對蒼術(shù)多酚的研究報道。多酚是廣泛分布于植物體內(nèi)的一類重要的次生代謝物質(zhì),化學(xué)性質(zhì)獨特,藥理活性多樣,已經(jīng)成為評價藥材質(zhì)量的指標(biāo)成分之一,在食品、醫(yī)藥保健、化學(xué)及化妝品等領(lǐng)域均有應(yīng)用,因此對蒼術(shù)多酚展開研究十分必要。本實驗采用響應(yīng)面法研究了北蒼術(shù)多酚的提取工藝，并探討了北蒼術(shù)多酚的體外DPPH自由基清除能力,以期為蒼術(shù)資源的綜合開發(fā)利用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北蒼術(shù)采自陜西省太白縣,經(jīng)西安文理學(xué)院杜喜春副教授鑒定為菊科蒼術(shù)屬植物北蒼術(shù),取其根部干燥后粉碎過孔徑為0.425mm篩,保存?zhèn)溆谩?/p>

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購于美國Sigma公司,純度>98.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù));沒食子酸購于陜西標(biāo)普醫(yī)藥科技有限公司,純度>98.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù));抗壞血酸(純度>98.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)))和甲醇、無水碳酸鈉(分析純)均購于天津市天力化學(xué)試劑有限公司;Folin-Ciocalteu試劑購于上海荔達(dá)生物科技公司。

WN-200多功能粉碎機(jī)，廣州旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司;TE412-L型電子天平，德國Sartorius儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司;KH-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;三用恒溫水箱，天津泰斯特儀器有限公司;TDL-5-A型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;UV-2550紫外可見分光光度計，日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 北蒼術(shù)多酚的提取工藝 準(zhǔn)確稱量5.0 g北蒼術(shù)粉末于玻璃瓶中,按液料比加入不同濃度的乙醇提取溶劑,混合均勻后放入功率為240 W的超聲波中超聲一定時間,超聲結(jié)束后真空抽濾得淺棕色濾液。

1.2.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱量標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸13 mg,用甲醇溶解并稀釋至50 mL棕色容量瓶中,搖勻,即得濃度為0.26 mg/mL沒食子酸溶液。

精密移取該溶液0，0.1，0.4，0.5，0.6，0.8 mL于25 mL棕色容量瓶中,分別加入蒸餾水10.0 mL,Folin-Ciocalteu試劑2.0 mL,充分振蕩搖勻后靜置8 min,再依次加入15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Na2CO3溶液2.0 mL,搖勻后定容,室溫下避光靜置反應(yīng)2 h。以第1瓶空白溶液作參比,測定765 nm波長處的吸光度。

1.2.3 北蒼術(shù)多酚的測定 采用Folin-Ciocalteu分光光度法測定北蒼術(shù)多酚含量[15]。取北蒼術(shù)濾液50 μL,于765 nm處測定吸光度值,將該值代入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,計算北蒼術(shù)多酚的濃度。按公式(1)計算北蒼術(shù)多酚的提取量,以沒食子酸當(dāng)量表示。

M=(X*V1*V0)/(M1*V2)

(1)

式中：M為北蒼術(shù)多酚提取量,mg/g;X為標(biāo)準(zhǔn)曲線求出的北蒼術(shù)多酚濃度,mg/mL;V0為提取北蒼術(shù)多酚時定容后的體積,mL;V1為測定北蒼術(shù)多酚時定容后的體積,mL;V2為測定多酚時移取的北蒼術(shù)濾液的體積,mL;M1為提取北蒼術(shù)多酚時北蒼術(shù)粉末質(zhì)量,g。

1.2.4 單因素實驗 以乙醇濃度70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、液料比25mL/g、超聲時間40 min為固定水平,考察各單因素水平對北蒼術(shù)多酚提取量的影響,以確定后續(xù)實驗的最佳提取工藝參數(shù)范圍。各因素分別設(shè)置6個水平,具體為乙醇濃度40%，50%，60%，70%，80%，90%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),液料比5，10，15，20，25，30mL/g,超聲時間10，20，30，40，50，60min。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝實驗設(shè)計 在單因素實驗基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法設(shè)計優(yōu)化超聲波輔助提取北蒼術(shù)多酚的實驗方法,選取乙醇濃度(A),液料比(B)和超聲時間(C)作為影響多酚提取優(yōu)化的因素,以多酚提取量為響應(yīng)值。根據(jù)Box-Behnken設(shè)計進(jìn)行3因素3水平的實驗，響應(yīng)面設(shè)計實驗因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素水平及編碼表Tab.1 Levels and factors of response surface design

1.2.6 DPPH自由基清除能力 將提取得到的北蒼術(shù)多酚和抗壞血酸配成系列濃度為40，80，160，320，640，1 280，2 560和4 000 μg/mL的樣品溶液,取各濃度樣品溶液2 mL分別放置于刻度試管中,加入0.2 mmol/L無水乙醇配制的DPPH自由基溶液2 mL,混勻后室溫暗處反應(yīng)30 min,517 nm波長下測吸光度值。以2 mL樣品液加入2 mL無水乙醇作為空白組,以2 mL蒸餾水加入2 mL DPPH自由基溶液作為對照組,根據(jù)公式(2)計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100%

(2)

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 所有實驗均重復(fù)3次,實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。運用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計和分析,應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果

采用沒食子酸溶液質(zhì)量濃度(mg/mL)作為橫坐標(biāo),對應(yīng)吸光度值作為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為Y=68.287X+0.003(R2=0.995 3)。

2.2 單因素實驗

圖1 乙醇濃度對北蒼術(shù)多酚提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols

2.2.1 乙醇濃度對北蒼術(shù)多酚提取量的影響 不同濃度的乙醇對北蒼術(shù)多酚提取量的影響結(jié)果見圖1。北蒼術(shù)多酚的提取量隨著乙醇濃度的增大而增大,當(dāng)乙醇濃度為70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時,北蒼術(shù)多酚提取量達(dá)到最大,隨著乙醇濃度的繼續(xù)增大,北蒼術(shù)多酚提取量下降。可見,70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的乙醇濃度可以使北蒼術(shù)多酚有較好的提取量。乙醇溶劑提取法是提取多酚類物質(zhì)的常用方法,已被廣泛應(yīng)用于石榴[15]、獼猴桃[16]、西藏野生卷葉黃精[17]、黔產(chǎn)接骨草[18]、窄葉鮮卑花[19]、米糠[20]等植物多酚類物質(zhì)的提取中。不同植物含有的多酚類物質(zhì)成分有差異,導(dǎo)致其極性不同,而不同濃度的乙醇溶劑亦有不同的極性[21],因此,提取不同植物多酚類物質(zhì)應(yīng)根據(jù)相似相溶的原理選用不同濃度的乙醇溶液。本實驗發(fā)現(xiàn),70%的乙醇濃度可以使北蒼術(shù)多酚有較好的提取量,可能是70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的乙醇溶液的極性和北蒼術(shù)多酚的極性相似,故具有較大的溶解度。

2.2.2 液料比對北蒼術(shù)多酚提取量的影響 不同液料比對北蒼術(shù)多酚提取量的影響結(jié)果見圖2。北蒼術(shù)多酚的提取量隨著液料比的增加而增大,當(dāng)液料比為25mL/g時,北蒼術(shù)多酚提取量達(dá)到最大,隨著液料比的繼續(xù)增加,北蒼術(shù)多酚提取量下降?？梢?25mL/g的液料比可以使北蒼術(shù)多酚有較好的提取量。低濃度的液料比使北蒼術(shù)多酚提取不充分,高濃度的液料比會導(dǎo)致一些其他物質(zhì)如多糖溶出,從而抑制多酚提取量[22],因此,合適的液料比對多酚類物質(zhì)的有效提取至關(guān)重要。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),米糠[20]和石榴渣[15]多酚提取時的液料比為20mL/g,獼猴桃果皮[16]和西藏野生卷葉黃精[17]多酚提取時的液料比為25mL/g,窄葉鮮卑花[19]和黔產(chǎn)接骨草[18]多酚提取時的液料比分別為60mL/g和75mL/g,由此可知,不同植物多酚類物質(zhì)提取所用的液料比均不同,實驗時應(yīng)根據(jù)具體的實驗材料選擇合適的液料比。

圖2 液料比對北蒼術(shù)多酚提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of polyphenols

2.2.3 超聲時間對北蒼術(shù)多酚提取量的影響 不同超聲時間對北蒼術(shù)多酚提取量的影響結(jié)果見圖3。北蒼術(shù)多酚的提取量隨著超聲時間的增加而增大,在超聲時間為40 min時,北蒼術(shù)多酚的提取量達(dá)到最大,之后超聲時間增加,北蒼術(shù)多酚提取量下降?？梢?40 min的超聲時間可以使北蒼術(shù)多酚有較好的提取量。研究證明,合適的超聲時間可以讓多酚提取的過程反應(yīng)完全,過長的超聲時間會因為機(jī)械力和熱能破壞多酚結(jié)構(gòu),導(dǎo)致多酚提取量降低[23]。以往實驗報道,超聲輔助提取獼猴桃果皮[16]和黔產(chǎn)接骨草[18]多酚時的超聲時間分別為25 min和50 min,本實驗發(fā)現(xiàn),40 min的超聲時間可以使北蒼術(shù)多酚有較好的提取量,而采用傳統(tǒng)提取法提取米糠[20]、西藏野生卷葉黃精[17]和石榴渣[15]多酚時,其提取時間分別為2 h，2.5 h和3.5 h。可見,超聲提取法提取時間明顯縮短。

圖3 超聲時間對北蒼術(shù)多酚提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of polyphenols

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 響應(yīng)模型的建立與方差分析 利用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行Box-Behnken實驗設(shè)計,結(jié)果見表2。

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸模型方程擬合,得到以乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時間(C)為影響因素的北蒼術(shù)多酚提取量(mg/g)的回歸方程:北蒼術(shù)多酚提取量(mg/g)=11.79+0.33A+0.094B-0.075C+0.035AB-0.26AC+0.39BC-0.69A2-0.95B2-0.70C2。

根據(jù)p值可知,一次項A，交互項AC，BC和二次項A2，B2和C2對多酚提取量的影響極顯著,一次項B對多酚提取率影響顯著,影響大小順序為:乙醇濃度>液料比>超聲時間。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化 影響北蒼術(shù)多酚提取量各因素間的交互作用的響應(yīng)曲面如圖4～6所示，可以得到乙醇濃度、液料比、超聲時間之間交互關(guān)系的直觀表現(xiàn)。響應(yīng)曲面圖的拋物面越明顯,因素之間的交互作用越強(qiáng);響應(yīng)曲面圖的拋物面越不明顯,因素之間的交互作用越弱[24]。結(jié)合P值分析可知,因素間交互作用的影響為:液料比-超聲時間的交互影響>乙醇濃度-超聲時間的交互作用,而乙醇濃度-液料比間的交互作用影響不顯著。

表2 北蒼術(shù)多酚提取響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果Tab.2 Experiment design and results for response surface analysis

表3 回歸模型方差分析表Tab.3 Analysis of variance of the regression model

注:* 表示差異顯著(P<0.05),** 表示差異極顯著(P<0.01)

2.3.3 最優(yōu)提取工藝驗證 由響應(yīng)面法分析數(shù)據(jù)可得出北蒼術(shù)中多酚的最佳提取工藝為:乙醇濃度為73.98%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),液料比24.86 mL/g,超聲時間36.8 min,多酚的理論最佳提取量為11.90 mg/g。

根據(jù)模型預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗證實驗,優(yōu)化實驗條件為乙醇濃度74%,液料比25mL/g,超聲時間37 min,通過3次平行試驗,求得多酚的提取量為11.67±0.15 mg/g,與理論值的誤差為1.97%,說明該回歸方程能夠真實地反映各因素對北蒼術(shù)多酚提取量的影響,可在實際生產(chǎn)中應(yīng)用。

圖4 乙醇濃度和液料比對多酚提取量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration and liquid-solid ratio on the yield of polyphenols

圖5 乙醇濃度和超聲時間對多酚提取量的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration and ultrasonic time on the yield of polyphenols

圖6超聲時間和液料比對多酚提取量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time and liquid-solid ratio on the yield of polyphenols

2.4 DPPH自由基清除能力測定結(jié)果

北蒼術(shù)多酚提取液對DPPH自由基清除率的結(jié)果見圖7。由圖7可知,北蒼術(shù)多酚提取液和抗壞血酸對DPPH自由基均有一定的清除作用,且隨著其質(zhì)量濃度的增加,清除率也增加,清除率最高分別可達(dá)到63.98%和96.02%。北蒼術(shù)多酚提取液對DPPH自由基的清除能力可以用DPPH自由基清除率為50%時所對應(yīng)的樣品濃度(IC50)來衡量。經(jīng)分析計算得出,北蒼術(shù)多酚提取液和抗壞血酸的IC50值分別為2.10 mg/mL和0.05 mg/mL,與抗壞血酸相比,北蒼術(shù)多酚提取液對DPPH自由基清除能力較弱。根據(jù)計算出的IC50值可知,北蒼術(shù)多酚提取液具有清除DPPH自由基的能力,后續(xù)可通過分離純化實驗獲得清除能力更強(qiáng)的多酚物質(zhì)。

圖7 北蒼術(shù)多酚提取液對DPPH自由基的清除率Fig.7 DPPH radical scavenging activity of the extract of polyphenols

3 結(jié) 論

本實驗首先通過單因素試驗分析不同因素對北蒼術(shù)多酚提取量的影響,確定合適的提取條件;再采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助北蒼術(shù)多酚的提取工藝,并利用Design-Expert軟件分析了影響北蒼術(shù)多酚提取量的因素。其中，乙醇濃度和液料比對多酚提取量影響顯著,液料比和超聲時間的交互作用以及乙醇濃度和超聲時間的交互作用顯著。最終，得出其最佳提取工藝為:乙醇濃度74%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),液料比25mL/g,超聲時間37 min,在此條件下北蒼術(shù)多酚提取量達(dá)到(11.67±0.15) mg/g,且得到的北蒼術(shù)多酚具有較好的清除自由基的能力,可以作為天然抗氧化劑進(jìn)行開發(fā)。超聲波輔助提取植物多酚是一種有效的途徑,利用超聲波輔助提取北蒼術(shù)多酚可為蒼術(shù)資源的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù),并有利于產(chǎn)業(yè)化推廣,具有良好的應(yīng)用前景。

[1] 李云霞, 李沈明, 商春麗. 承德發(fā)展蒼術(shù)種植的可行性分析[J]. 中草藥, 2013, 44 (9): 1215-1218.

[2] 李萬娟, 郭艷玲, 商春麗, 等. 北蒼術(shù)化學(xué)成分的GC-MS分析[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2016, 22 (6): 66-70.

[3] PING J, JULIE T C, CORNELIUSEN B, et al. Lipase inhibition and antiobesity effect of Atractylodes lancea [J]. Planta Med, 2014, 80 (7): 577-582.

[4] KOONRUNGSESOMBOON N, NA BANGCHANG K, KARBWANG J. Terapeutic potential and pharmacological activities of Atractylodes lancea (Tunb.) DC [J]. Asian Pac J Trop Med, 2014, 7 (6): 421-428.

[5] RESCH M, STEIGEL A, CHEN Z L, et al. 5-Lipoxygenase and cyclooxygenase-1 inhibitory active compounds from Atractylodes lancea [J]. J Nat Prod, 1998, 61 (3): 347-350.

[6] XU K, YANG Y N, FENG Z M, et al. Six new compounds from Atractylodes lancea and their hepatoprotective activities [J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2016, 26 (21): 5187-5192.

[7] CHEN F, REN C G, ZHOU T, et al. A novel exopolysaccharide elicitor from endophytic fungus Gilmaniella sp. AL12 on volatile oils accumulation in Atractylodes lancea [J].Scientific Reports,2016,6:34735.

[8] ZHEN Ouyang, LEI Zhang, MING Zhao, et al. Identification and quantification of sesquiterpenes and polyacetylenes in Atractylodes lancea from various geographical origins using GC-MS analysis [J]. Rev Bras Farmacogn, 2012, 22 (5): 957-963.

[9] KUO Xu, FENG Ziming, YANG Yanan, et al. Eight new eudesmane-and eremophilane-type sesquiterpenoids from Atractylodes lancea [J]. Fitoterapia, 2016, 114: 115-121.

[10] NAKAI Y, SAKAKIBARA I, HIRAKURA K, et al. A new acetylenic compound from the rhizomes of Atractylodes chinensis and its absolute configuration [J]. Chem Pharm Bull, 2005, 53 (12): 1580-1581.

[11] WANG K T, CHEN LG, YANG L L, et al. Analysis of the sesquiterpenoids in processed Atractylodis Rhizoma [J]. Chem Pharm Bull, 2007, 55 (1): 50-56.

[12] LIU Qiutao, ZHANG Shanshan, YANG Xihui, et al. Differentiation of essential oils in Atractylodes lancea and Atractylodes koreana by gas chromatography with mass spectrometry [J]. J Sep Sci, 2016, 39 (24): 4773-4780.

[13] CHU Shasha, JIANG Guohua, LIU Zhilong. Insecticidal compounds from the essential oil of Chinese medicinal herb Atractylodes chinensis [J]. Pest Manag Sci, 2011, 67 (10): 1253-1257.

[14] TAKAEDA O, MIKI E, TERABAYASHI S, et al. A comparative study on essential oil components of wild and cultivated Atractylodes lancea and A. chinensis [J]. Planta Med, 1996, 62 (5): 444-449.

[15] 趙光遠(yuǎn), 許艷華, 陳美麗, 等. 石榴渣多酚提取及抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2017, 38 (5): 228-232.

[16] 郭彩霞, 任曉婷, 張生萬, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取獼猴桃果皮多酚工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2017, 38 (11): 244-250.

[17] 張國強(qiáng), 郭曉東, 薛文華, 等. 西藏野生卷葉黃精多酚的提取及其抗氧化活性分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38 (6): 236-241.

[18] 黃雅, 陳華國, 周欣, 等. 黔產(chǎn)接骨草中總多酚的含量測定及抗氧化活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2017, 29 (2): 255-263.

[19] 衛(wèi)陽飛, 劉東花, 張宏曦, 等. 窄葉鮮卑花葉中黃酮和多酚的超聲提取工藝及抗氧化性研究[J]. 中藥材, 2017, 40 (1): 158-163.

[20] 徐彩紅, 馬麗鑫, 李桂杰, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化米糠多酚的醇提工藝[J]. 食品工業(yè)科技, 2017, 38 (16): 194-198.

[21] CHEW K, KHOO M, NG S, et al. Effect of ethanol concentration, extraction time and extraction temperature on the recovery of phenolic compounds and antioxidant capacity of Orthosiphon stamineus extracts [J]. International Food Research Journal, 2011, 18 (4): 571-578.

[22] YUE T, SHAO D, YUAN Y, et al. Ultrasound assisted extraction, HPLC analysis, and antioxidant activity of polyphenols from unripe apple[J]. Journal of Separation Science, 2012, 35 (16): 2138-2145.

[23] 胡明明, 張國文, 何力, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取花生殼多酚[J]. 南昌大學(xué)學(xué)報(理科版), 2011, 35 (3): 241-246.

[24] 樊燕鴿, 張娟梅, 黃做華. 響應(yīng)面法優(yōu)化懷菊水溶性總多酚的超聲提取工藝[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37 (5): 268-272.