宋 怡，孔凡建，李銀科，王 泉

維生素K是一類天然存在的脂溶性維生素，維生素K2（甲基萘醌類，Menaquinone，簡稱MK）是一組在2-甲基-1，4-萘醌母核上有不同長度的聚異戊二烯側(cè)鏈的化合物。Menaquinone-7（MK-7）屬于維生素K2中的一類，它的側(cè)鏈含有7個異戊二烯基團，結(jié)構(gòu)式見圖1。

維生素 K2主要通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生［1－2］，也可由人工合成得到［3］。研究發(fā)現(xiàn)，維生素K2具有治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松［4－6］、促進凝血等功能［7］，同時在治療肝癌［8－9］、乳腺癌［10］等方面表現(xiàn)出良好的療效。MK-7作為維生素K2最重要的一類，還具有防止血管鈣化，降低冠狀動脈心臟病的風(fēng)險［11］，以及治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的功能［12］。

圖1 MK-7的結(jié)構(gòu)式Fig．1 Structural f or mula of MK-7

目前，尚未見到用超高效液相色譜法測定MK-7原料藥主成分及有關(guān)物質(zhì)的報道。本工作參考了國外對母乳、血液、食品中維生素K2的測定方法［13－17］，應(yīng)用超高相液相色譜分析技術(shù)對 MK-7原料藥主成分及有關(guān)物質(zhì)進行測定，擬為MK-7質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity型超高效液相色譜系統(tǒng)，配二極管陣列檢測器（DAD）和Open LAB CDS工作站；TB-215D型十萬分之一電子天平；Elga型超純水機。

對照品溶液：避光操作，稱取 MK-7對照品25．21 mg置于25 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對照品儲備溶液。移取1．00 mL對照品儲備溶液，置于10 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

MK-7對照品純度為99．1%，無水乙醇、異丙醇為分析純，甲醇為色譜純，試驗用水為超純水。

1．2 儀器工作條件

Agilent Eclipse pl us C18色譜柱 （2．1 mm×50 mm，1．8μm）；流動相為甲醇-水（98＋2）混合液；流量0．3 mL·min－1；檢測波長為246 n m（主成分測定），270 n m（有關(guān)物質(zhì)測定）；柱溫30℃；進樣量2μL。

1．3 試驗方法

避光條件下，稱取MK-7原料藥25．12 mg置于25 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇超聲溶解并定容，搖勻，制成供試品儲備溶液。移取供試品儲備溶液1．00 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，配制供試品溶液，在儀器工作條件下進行測定。

移取4．00 mL供試品儲備溶液，置于10 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為有關(guān)物質(zhì)供試品溶液。移取上述溶液1．00 mL置于50 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為有關(guān)物質(zhì)對照溶液，在儀器工作條件下進行測定。

2 結(jié)果與討論

2．1 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器對供試品溶液在波長200～400 n m內(nèi)進行掃描，發(fā)現(xiàn)在波長246，270 n m處有最大吸收，見圖2。

圖2 MK-7紫外吸收光譜Fig．2 UV adsorption spectru m of MK-7

由圖2可知：在波長246 n m處，雜質(zhì)較少，無干擾；在270 n m處，雜質(zhì)有明顯吸收，且基線噪聲較小。試驗選擇270 n m為有關(guān)物質(zhì)的檢測波長，246 n m為MK-7的檢測波長。

2．2 溶劑的選擇

分別用異丙醇、甲醇、無水乙醇溶解并稀釋供試品，制成3份質(zhì)量濃度為0．1 g·L－1的溶液，按儀器工作條件進樣分析。3份溶液的峰形及對稱性均較好，而異丙醇和無水乙醇能較快溶解樣品，甲醇溶解樣品的時間較長。從經(jīng)濟性方面考慮，試驗選擇無水乙醇作為溶劑。

2．3 專屬性考察

取0．2 g·L－1供試品溶液共5份，1份在70℃恒溫水浴中加熱1 h，作為高溫破壞溶液；1份在4300lx的強光下照射1 h，作為光照破壞溶液；其余3份分別加入0．1 mol·L－1鹽酸溶液、0．1 mol·L－1氫氧化鈉溶液、30 g·L－1過氧化氫溶液各1 mL加熱1 h，并調(diào)節(jié)p H至中性，分別作為酸破壞溶液、堿破壞溶液、氧化破壞溶液。將5份專屬性溶液和1份0．2 g·L－1供試品溶液按儀器工作條件，在波長270 n m下進樣分析，色譜圖見圖3。

圖3 不同條件下MK-7專屬性試驗的色譜圖Fig．3 Chro matograms of specificity test of MK-7 under different conditions

由圖3可知：MK-7在酸、堿、光照、高溫及氧化條件下均不穩(wěn)定，不同程度分解而產(chǎn)生雜質(zhì)；但在上述色譜條件下各雜質(zhì)峰與主成分峰均能較好地分離，對MK-7及有關(guān)物質(zhì)的測定無干擾，說明建立的方法具有良好的專屬性。由圖3還可知：MK-7在堿性條件下幾乎完全分解，在光照下產(chǎn)生的雜質(zhì)較多，說明該物質(zhì)對光敏感，易被堿破壞，故在生產(chǎn)、運輸和儲存的過程中應(yīng)采取避光措施，并避免與堿性物質(zhì)的接觸。

2．4 系統(tǒng)適用性試驗

分別將對照品溶液、供試品溶液和空白溶液，按儀器工作條件在波長246 n m處進樣分析，色譜圖見圖4。MK-7的保留時間為7．05 min，理論塔板數(shù)為10 889，拖尾因子為0．94。

2．5 方法學(xué)考察

2．5．1 線性范圍與檢出限

移取MK-7對照品儲備溶液適量，配制成質(zhì)量濃度分別為0．005，0．010，0．025，0．050，0．100，0．200，0．400 g·L－1的對照品溶液系列，按儀器工作條件在波長246 n m處進樣分析，記錄色譜圖及峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）和MK-7質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進行線性回歸，MK-7的線性范圍為0．005～0．400 g·L－1，線性回歸方程為y＝1．430×104x－3．620×101，相關(guān)系數(shù)為0．999 8。

按3倍信噪比時的質(zhì)量濃度計算得檢出限（3S／N）為0．1 mg·L－1。

圖4 對照品溶液、供試品溶液、空白溶液的色譜圖Fig．4 Chr o matograms of standard solution，sa mple solution and blank solution

2．5．2 精密度試驗

平行配制6份供試品溶液，在波長246 n m處進樣分析，測得MK-7質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值為98．0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0．6%，說明方法的精密度較高。

2．5．3 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，在10℃下避光保存12 h，每隔2 h進樣一次，按儀器工作條件在波長246 n m處分析，測得MK-7峰面積的RSD為0．7%。說明供試品溶液在12 h內(nèi)，10℃避光條件下穩(wěn)定性良好。

2．5．4 回收試驗

稱取MK-7供試品適量，按試驗方法進行加標(biāo)回收試驗，結(jié)果見表1。

表1 回收試驗結(jié)果Tab．1 Results of test for recovery

2．6 樣品分析

稱取2批MK-7原料藥，按試驗方法配制供試品溶液，在波長246 n m處進樣分析。按外標(biāo)法以峰面積計算MK-7的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

表2 樣品中MK-7的測定結(jié)果（n＝3）Tab．2 Deter mination results of MK-7 in sa mples（n＝3）

2．7 有關(guān)物質(zhì)測定

稱取2批MK-7原料藥，按試驗方法配制有關(guān)物質(zhì)溶液，移取對照溶液2μL，在波長270 n m處進樣分析，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的25%，再移取有關(guān)物質(zhì)供試品溶液和對照品溶液各2μL，按儀器工作條件進樣分析，記錄色譜圖至主成分保留時間的3倍，以自身對照法計算雜質(zhì)含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果Tab．3 Deter mination results of the related substances in samples

由表3可知：2批MK-7原料藥中單個雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)未超過0．5%，雜質(zhì)總質(zhì)量分?jǐn)?shù)未超過1．0%，故可將單個雜質(zhì)限量定為0．5%，雜質(zhì)總量限量定為1．0%。

本工作應(yīng)用超高效液相色譜技術(shù)，建立了測定MK-7原料藥主成分和有關(guān)物質(zhì)的方法。本方法分析時間短，專屬性強，檢出限低，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為MK-7原料藥的分析方法，用于其主成分與有關(guān)物質(zhì)的檢測分析，可為MK-7原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。參考文獻：

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