常青燕　朱杰　張曉慧　來有雪　盛亮亮

【摘要】 目的：研究Treg與Th17細胞在慢性丙型肝炎患者外周血CD4+細胞中表達百分率的變化及意義，探討其在慢性丙型肝炎發(fā)病中的作用。方法：使用四色流式細胞儀，分別檢測慢性丙型肝炎患者和正常健康人外周血CD4+細胞中Treg與Th17細胞的表達百分率情況，并分別計算Treg/Th17值。結(jié)果：慢性丙肝組與健康對照組的Treg細胞百分率比較[（7.56±1.32）% vs（5.05±0.46）%，P<0.01]，Th17細胞百分率比較[（2.12±0.55）% vs（1.19±0.12）%，P<0.01]，Treg/Th17細胞比例比較[（3.66±0.42）vs（4.25±0.45），P<0.01]。且Treg細胞與Th17表達百分率HCV-RNA病毒載量呈正線性相關(guān)，與轉(zhuǎn)氨酶ALT含量無關(guān)。結(jié)論：可以將Treg、Th17細胞亞群的含量作為快速輔助判斷丙肝患者所處感染的不同臨床時期的有效證據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 流式細胞術(shù)； Treg細胞； Th17細胞； 慢性丙型肝炎

Expression Changes and Significance of Treg and Th17 Cells in Peripheral Blood CD4+ Cells in Chronic Hepatitis C/CHANG Qingyan，ZHU Jie，ZHANG Xiaohui，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（32）：014-018

【Abstract】 Objective：To study the changes and significance of Treg and Th17 cells in peripheral blood CD4+ cells in patients with chronic hepatitis C and to explore its role in the pathogenesis of chronic hepatitis C.

Method：The expression percentage of Treg and Th17 cells in CD4+ cells in patients with chronic hepatitis C and normal healthy people were detected by four-color flow cytometry，and Treg/Th17 was calculated respectively.Result：The percentage of Treg cells in patients with chronic hepatitis C and normal healthy people were（7.56±1.32）%，（5.05±0.46）%，Th17 cells percentage were （2.12±0.55）%，（1.19±0.12）%，Treg/Th17

cells proportion were （3.66±0.42），（4.25±0.45），there were statistical significance（P<0.01）.And the percentage of Treg and Th17 cells was positive linear correlation with HCV-RNA viral load and had nothing to do with the elevation of ALT.Conclusion：The contents of Treg and Th17 cell subgroups can be used as the effective evidence for the rapid adjuvant assessment of the different clinical stages of infection in patients with chronic hepatitis C.

【Key words】 Flow cytometry； Treg cell； Th17 cell； Chronic hepatitis C

First-authors address：Dalian Sixth Peoples Hospital，Dalian 116113，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.32.004

丙肝發(fā)病和轉(zhuǎn)歸機制與Treg與Th17這兩類不同的細胞亞群失去平衡密切相關(guān)。盡管Treg、Th17的免疫應(yīng)答與胞內(nèi)感染涉及到的防御和清除有關(guān)，但這兩者的參與同時也可以導(dǎo)致肝組織損傷。適宜的Treg、Th17免疫應(yīng)答能夠有效清除HCV感染，提示可以研究出有效的免疫調(diào)節(jié)治療方法，即通過調(diào)節(jié)Treg和Th17的平衡來清除病毒。因此，筆者采用流式細胞儀對慢性丙肝患者外周血T細胞亞群中的Treg與Th17的表達情況進行詳細分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經(jīng)過大連市第六人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者被知情告知，并已簽署知情同意書。本研究中慢性丙型肝炎患者均符合2015年《丙型肝炎防治指南》慢性丙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除與HBV混合感染及與HIV混合感染的患者，排除有嚴(yán)重肝功能障礙、嚴(yán)重心臟病史及嚴(yán)重精神病史患者，排除妊娠及哺乳期的患者，為未經(jīng)抗病毒治療的初治成年患者。本研究中慢性丙型肝炎患者均由遼寧省大連市第六人民醫(yī)院招募入組，入組時間為2015年8月-2016年9月，共入組慢性丙型肝炎患者19例（慢性丙肝組），其中男10例，女9例，年齡23～79歲，平均（46.16±15.09）歲；健康受試者均由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院招募入組，入組時間為2016年5-10月，共入組健康受試者20例（健康對照組），其中男11例，女9例，年齡23～77歲，平均（46.00±11.91）歲。endprint

1.2 儀器與設(shè)備 BD FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）、YS72 5KVA凈化式交流穩(wěn)壓電源（中國上海科技儀器儀表廠）、HH·W21·600-S電熱數(shù)顯恒溫水浴箱（中國躍進醫(yī)療器械廠）。

1.3 試劑 主要試劑：FOXP3-PE，CD4-FITC，CD25-APC，PE Rat IgG2a，IL-17-PE單抗購自COULTER公司，CD3-PerCP、CD4-APC、CD3-APC

購自BD公司，鼠FITC-IgG1/PE-IgG1單抗為Pharming公司產(chǎn)品。其他試劑：PMA、Ionomycin、BFA等均購自Sigma公司，RPMI1640購自Gibco公司，固定穿透試劑盒，Cytopem kit購PharMingen公司。

1.4 方法

1.4.1 首先，選擇合適的健康人群，分別采取靜脈血1 mL，使用肝素作為最佳抗凝劑。兩者混勻后，按抗凝后靜脈血同RPMI1640（無血清）的培養(yǎng)基按照1∶1的比例在振蕩器上充搖混勻。然后，分別向培養(yǎng)皿里注入Neomycin與PMA刺激劑，使得溶質(zhì)最終濃度分別達到20 ng/mL和1.5 μg/mL，最后加入15 μg/mL的BFA作為蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑。未加刺激液的對照組則只加BFA。充分搖勻后，將培養(yǎng)基放置在37.5 ℃、5%CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。隨后待用。

1.4.2 （1）Treg細胞檢測。①分別拿2支試管并對其編號，將相應(yīng)患者使用肝素抗凝的外周血100 μL分別加入到相應(yīng)編號的試管中，充分搖勻。②兩只試管中加入10 μL CD4-FITC抗體，其中管A加3 μL CD25-APC抗體，另一管B加3 μL FITC-IgG1，混勻，室溫避光保存15～30 min（可根據(jù)實驗所處環(huán)境，參考試劑相應(yīng)說明書，調(diào)整抗體使用情況）。③然后，加入1 mL新鮮制備的e Bioscience Fixation/Demobilization應(yīng)用液，混勻，室溫避光保存30 min。

④取出試管后，分別加入用稀釋液稀釋10倍的Demobilization Buffer洗液2 mL。使用離心機1500 r/min離心5 min，然后充分棄去上清液。按照上述方法與步驟再清洗三遍。⑤管A加入5 μL FoxP3-PE標(biāo)記的抗體和管B 1 μL rat IgG2b

與2 μL eBR2a同型對照（e Bioscience）。搖

勻后放于4 ℃的恒溫孵育箱內(nèi)，避光孵育4 h。⑥取出試管，同步驟④洗三遍。⑦充分棄去上清液，同時相應(yīng)加入1 mL PBS或去離子水，保證在1.5 h內(nèi)上機實驗。（2）Th17細胞檢測。①分別拿2支試管并對其編號，將相應(yīng)患者使用肝素抗凝的外周血100 μL分別加入到相應(yīng)編號的試管中，充分搖勻，同時分別加入0.5 mL PMA于37 ℃水浴保存6 h。②另取2支試管并編號，將步驟①中兩管各取200 μL加入到相應(yīng)編號C、D的試管中并同時加入20 μL CD4-FITC，混勻，室溫避光保存15～30 min（可根據(jù)實驗所處環(huán)境，參考試劑相應(yīng)說明書，調(diào)整抗體使用情況）。③然后，加入1 mL新鮮制備的e Bioscience/Demobilization應(yīng)用液?；靹?，室溫避光保存30 min。④取出試管后，分別加入用稀釋液稀釋10倍的Demobilization Buffer洗液2 mL。使用離心機1500 r/min離心5 min，然后充分棄去上清液。按照上述方法與步驟再清洗三遍。⑤管C加入10 μL IL-17-PE標(biāo)記的抗體和10 μL IFN-r-FITC，D管加入5 μL IgG2a-PE，混勻放入4 ℃孵育箱避光孵育3 h。⑥取出試管，同步驟④洗兩遍。⑦充分棄去上清液，同時相應(yīng)加入1 mL PBS或去離子水。保證在1.5 h內(nèi)上機實驗

1.4.3 數(shù)據(jù)獲取及分析 首先按照使用說明，進行相應(yīng)的預(yù)實驗。通過對預(yù)實驗的分析，對流式細胞儀的光路和液路進行校準(zhǔn)，使得調(diào)試后的儀器保持在最精準(zhǔn)的狀態(tài)。本次實驗將使用CD4、CD25設(shè)門，在FL1和FL2的熒光通道中，使用相應(yīng)鼠IgG2a染色細胞作為陰阻的分界線。仔細校對及設(shè)置各熒光通道之間的熒光補償，然后進行對Fox P3和IL-17的檢測。每管獲取細胞數(shù)100 000個，用Cellquest軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血Treg、Th17細胞檢測結(jié)果比較 與健康對照組相比，慢性丙肝組外周血Treg細胞百分率明顯升高（P=0.003），Th17細胞百分率明顯升高（P=0.000），Treg細胞/Th17細胞明顯減低（P=0.000），見表1。健康對照組Treg細胞（圖1），慢性丙肝組Treg細胞（圖2），健康對照組Th17細胞（圖3），慢性丙肝組Th17細胞（圖4）。

2.2 HCV-RNA含量和ALT與Treg細胞和Th17細胞百分率表達線性關(guān)系 HCV-RNA和ALT含量與Treg細胞和Th17細胞線性關(guān)系，見表2和3。HCV-RNA含量與Treg細胞百分率擬合曲線（圖5），HCV-RNA含量與Th17細胞百分率擬合曲線（圖6），ALT含量與Treg細胞百分率擬合曲線（圖7），ALT含量與Th17細胞百分率擬合曲線（圖8）。

3 討論

丙肝是丙肝病毒（HCV）感染機體后，引起機體炎癥反應(yīng)的感染性疾病，臨床表現(xiàn)為肝臟的急性或慢性炎癥。目前全世界范圍內(nèi)，大約有3億人感染或感染過HCV，85%的人群會逐漸發(fā)展為慢性肝損害，最終可能會發(fā)展成病毒性肝硬化和肝癌，這對人民身體的健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的危害[1]。endprint

機體在受到HCV感染后，感染初期先由機體的固有免疫應(yīng)答起主要作用。在感染早期，也就是急性期，由漿細胞參與的體液免疫反應(yīng)，除了接受相應(yīng)抗原刺激產(chǎn)生相應(yīng)特異性抗體，漿細胞還分泌大量細胞因子。其中，IFNβ可以誘導(dǎo)寡腺苷酸合成酶等而不斷抑制HCV的生長，并且具有激活細胞毒性T細胞及天然殺傷性細胞等免疫活性細胞，從而起到免疫應(yīng)答增強的作用[2]。由髓系樹狀細胞（MDC）激活的NKT細胞，也可以大量分泌IFNβ等細胞因子，進而同時增強巨噬細胞等非特異性免疫系統(tǒng)的功能。這些細胞因子可以增強局部炎癥的反應(yīng)性。所以，通常在HCV感染過后，機體固有的免疫應(yīng)答不能完全將丙肝病毒從體內(nèi)清除出去，這就要通過機體細胞免疫與體液免疫的免疫應(yīng)答來消滅相應(yīng)丙肝病毒[3-4]。

在機體中，存在一類可以調(diào)節(jié)控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的功能性T細胞亞群，又稱調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory cell，Treg）。適應(yīng)性調(diào)節(jié)性T細胞（aTreg或iTreg）和天然產(chǎn)生的自然調(diào)節(jié)性T細胞（nTreg）在人體中受到不同因素誘導(dǎo)產(chǎn)生，如CD4 Treg、NKT及Th3、Tr1等，其異常表達可能影響機體免疫自穩(wěn)功能，甚至發(fā)生自身免疫性疾病[5]。

近年來，新分離一種輔助性T細胞，它可以分泌IL-17，所以又稱為Th17。它與Th1和Th2的Th細胞表現(xiàn)不一樣，特別是在分化、生物學(xué)作用等方面。例如：慢性炎性反應(yīng)的介導(dǎo)、胞外細菌感染的防御以及自身免疫病等方面，均有突出作用。Th17細胞主要分泌的效應(yīng)因子是IL-17。T細胞可以合成分泌IL-17。這一家族包含6個成員的配體（IL-17A～IL-17F）與5個受體（IL-17RA～IL-17RD和SEF）[6]。

丙肝的發(fā)病原因及機制十分復(fù)雜，無論是急性起病還是轉(zhuǎn)歸為慢性，其確切機制尚未完全闡明。當(dāng)前比較被人們接受的觀點是丙肝的發(fā)病和轉(zhuǎn)歸與細胞性免疫密切相關(guān)[7]。

相關(guān)研究提示，HCV感染的發(fā)生、發(fā)展過程中Treg與Th17細胞亞群以及相關(guān)細胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)均參與其中[8]。近來也有研究發(fā)現(xiàn)，丙肝患者體內(nèi)Treg在外周血百分含量上升，它所起的抑制作用就會增強，但是這一過程致使HCV的特異性CD8+T細胞反應(yīng)性降低，進而使HCV發(fā)生持續(xù)的感染[9-10]。近幾年發(fā)現(xiàn)的一類新的CD4+T細胞亞群，是與調(diào)節(jié)性T細胞來源于同一前體細胞——Th17細胞，并且兩者在一定條件下可以互相轉(zhuǎn)化。已有研究表明：Th17細胞在感染性疾病、腫瘤中均發(fā)揮著非常重要的作用[9-12]。

關(guān)于丙肝患者Treg與Th17細胞亞群含量變化的機制尚未完全闡明。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)HCV核心蛋白及NS3蛋白可以促進Treg與Th17細胞分化，但是轉(zhuǎn)化生長因子β可以抑制其特異性Treg與Th17細胞的分化[13-15]。本研究結(jié)果顯示：與健康對照組相比，慢性丙肝組的Treg與Th17細胞頻率增高，Treg/Th17細胞比例降低，并且隨著HCV病毒載量的上升，Treg細胞和Th17細胞百分率不斷提高，與其成線性關(guān)系，與轉(zhuǎn)氨酶ALT含量無關(guān)。

綜上所述，丙肝發(fā)病和轉(zhuǎn)歸機制與Treg、Th17這兩類不同的細胞亞群失去平衡密切相關(guān)。盡管Treg、Th17的免疫應(yīng)答與胞內(nèi)感染涉及到的防御和清除有關(guān)，但這兩者的參與同時也可以導(dǎo)致肝組織損傷。適宜的Treg、Th17免疫應(yīng)答能夠有效清除HCV感染，提示可以研究出有效的免疫調(diào)節(jié)治療方法。即通過調(diào)節(jié)Treg和Th17的平衡來清除病毒。與此同時，可以將Treg、Th17細胞亞群在機體內(nèi)的含量，作為快速輔助判斷丙肝患者所處感染的不同臨床時期的有效證據(jù)。

參考文獻

[1] Hashempoor T，Bamdad T，Merat S，et al.Expansion of CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells in chronic Hepatitis C virus infection[J].Iran J Immunology，2010，7（3）：177-185.

[2] Yang B，Wang Y，Zhao C，et al.Increased Th17 cell sand inter leukin-17 contribute to immune activation and disease aggravation in patients with chronic hepatitis C virus infection[J].Immunology Lett，2013，149（1/2）：41-49.

[3] Man N，Littman D R.The differentiation of human TH-17 cells requires transforming growth factor-β and induction of the nuclear receptor RORγT[J].Nat Immunology，2008，9（6）：641-649.

[4]中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲學(xué)會、肝病學(xué)分會.病毒性肝炎防治方案[J].中華內(nèi)科雜志，2001，41（4）：62-68.

[5]王晨宇，王星，王琳，等.Th17細胞分化調(diào)節(jié)機制及與自身免疫性疾病關(guān)系研究進展[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志，2014，30（6）：660-662.

[6]王琴，吳錦林，倪兵.Th17細胞分化調(diào)節(jié)研究的最新進展[J].免疫學(xué)志，2009，25（6）：732-734，736.

[7]孫海青，婁金麗，劉新，等.急性肝衰竭時外周血和肝組織中調(diào)節(jié)性T細胞表達變化的初探[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，35（4）：447-451.

[8]謝文劍.慢性丙型肝炎患者外周血Th1/Th2細胞的檢測及其臨床意義的初步研究[D].南京：南京醫(yī)科大學(xué)，2003.endprint

[9]王萍，許冰，張麗君.慢性丙型肝炎患者外周血中Th17細胞的變化及其意義[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，44（10）：785-787.

[10]廖鳳，張曉紅，蔡慶賢，等.慢性丙肝外周血Th17/Th1水平與干擾素聯(lián)合利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)治療快速應(yīng)答的關(guān)系[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2012，26（3）：225-228.

[11] Park H，Li Z，Yang X O，et al.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue innammation by producing interleukin 17[J].Nat Immunol，2005，6（11）：1133-1141.

[12] Ji X J，Ma C J，Wang J M，et al.Immunomodulatory role of the hepatocyte during HCV infection：driving CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell development through the Tim-3/Gal-9 Pathway[J].Eur J Immunol，2013，43（2）：458-467.

[13] Maggio R，Viscomi C，Andreozzi P，et al.Normocaloric low cholesterol diet modulates Th17/Treg balance in patients with chronic hepatitis C virus infection[J].PLoS One，2014，9（12）：e 112 346.

[14] Fernandez-Ponce C，Dominguez-Villar M，Aguado E，et al.

CD4+ Primary T Cells Expressing HCV-Core Protein Upregulate Foxp3 and IL-10，Suppressing CD4 and CD8 T Cells[J].PLoS One，2014，9（1）：e85 191.

[15]劉晶晶，李慶彥，劉春華.不同病因肝衰竭患者外周血單個核細胞HLA-DR基因水平及血Th17和CD4+CD25+Treg細胞百分比的變化[J].實用肝臟病雜志，2015，18（6）：598-602.

（收稿日期：2017-09-08） （本文編輯：程旭然）endprint