葛百一 何璨

摘 要 單倍體育種技術(shù)可極大地提高玉米育種效率，在玉米育種中應(yīng)用廣泛，但也存在一系列問(wèn)題。本文對(duì)玉米單倍體育種的相關(guān)概念進(jìn)行了闡釋?zhuān)?duì)秋水仙素處理法和除草劑處理法的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，重點(diǎn)介紹了秋水仙素處理法中的浸種法、浸根法、浸芽法、針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法和滴注心葉法優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了分析，介紹了玉米單倍體加倍的環(huán)境影響和內(nèi)在機(jī)理研究進(jìn)展，為加快我國(guó)玉米單倍體育種提供參考。

關(guān)鍵詞 玉米 ；單倍體 ；加倍技術(shù)

中圖分類(lèi)號(hào) S513

Abstract The Haploid breeding technology could greatly improve the efficiency of maize breeding，it had wide application but also some problems. Some related concepts of Maize Haploid Breeding were explained， the research progress of colchicine treatment and herbicide treatment were summarized， the advantages and disadvantages of seed soaking， root soaking， budding， needle growing point method and heart leaf dripping method of colchicine treatment were analyzed. The environmental impact and internal mechanism of haploid doubling of maize were studied in order to provide reference for accelerating haploid breeding of maize in China.

Key words maize ； haploid ； doubling technique

玉米是世界上最重要的糧食和能源作物，也是中國(guó)重要的糧食作物。2017年中國(guó)玉米播種面積3 544.52萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量21 589.1萬(wàn)t，是中國(guó)第一大糧食作物，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了稻谷的3 017.6萬(wàn)hm2和20 856萬(wàn)t。因此，通過(guò)提高玉米育種水平進(jìn)而來(lái)提升玉米產(chǎn)量一直是我國(guó)重要的研究課題。但是，采用常規(guī)方法進(jìn)行玉米的自交系選育，耗時(shí)較長(zhǎng)，一般長(zhǎng)達(dá)4寠6年。采用單倍體育種技術(shù)可極大地縮短選育年限，在3季即可獲得純合的自交系，成為現(xiàn)代玉米育種不可或缺的育種手段之一，受到廣大育種工作者的極力推崇。筆者在對(duì)單倍體植株的相關(guān)概念進(jìn)行解釋的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)對(duì)單倍體加倍技術(shù)在玉米上的應(yīng)用進(jìn)行綜述，為推進(jìn)我國(guó)玉米單倍體育種提供參考。

1 單倍體育種相關(guān)概念

目前，植物單倍體產(chǎn)生的途徑主要有3種方法：一是自然發(fā)生單倍體，對(duì)玉米來(lái)說(shuō)，自然產(chǎn)生單倍體的頻率僅為0.1%[1-2]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足玉米育種的需要；二是人工誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，根據(jù)處理方法的不同，單倍體加倍率或雄花可育程度均有顯著提高；三是誘導(dǎo)系活體誘導(dǎo)單倍體技術(shù)，目前玉米育種中單倍體的誘導(dǎo)方法主要有花藥培養(yǎng)、雌配子體培養(yǎng)、物理化學(xué)方法，其中，第3種方法因其有效性和經(jīng)濟(jì)性成為當(dāng)前單倍體誘導(dǎo)的主流方法[3-6]。

單倍體鑒定是作物遺傳育種的基礎(chǔ)，目前鑒定技術(shù)包括了形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、解剖學(xué)、生理生化和遺傳標(biāo)記鑒定等。

2 玉米單倍體加倍技術(shù)

玉米單倍體本身無(wú)直接利用價(jià)值，也難以獲得后代。因此，需要對(duì)玉米單倍體進(jìn)行加倍，使其維持完成的染色體組，進(jìn)行正常生長(zhǎng)并獲得純合的后代，加倍方法主要有自然加倍及人工化學(xué)加倍2種。玉米單倍體自然加倍的頻率很低，一般低于5%，所以在單倍體育種過(guò)程中主要采用人工加倍方法。

2.1 秋水仙素處理法加倍

秋水仙素是目前最為常用的化學(xué)加倍試劑，已經(jīng)應(yīng)用于各種作物的育種過(guò)程中，一般在其溶液中添加二甲基亞砜、吐溫、細(xì)胞分裂素、甘油等增加其效率。添加二甲基亞砜、甘油等低分子量和中性溶質(zhì)，能增加溶液粘度，使秋水仙素等緩慢滲透到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部，減少其生理?yè)p傷。常用的方法有浸種法、浸根法、浸芽法、針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法和滴注心葉法。

浸種法操作較為簡(jiǎn)單，即直接將玉米單倍體種子置于不同濃度的秋水仙溶液浸泡。影響其加倍效率的除濃度外，還受浸泡時(shí)間、程序的影響，一般需要在浸泡前和浸泡后用清水處理一段時(shí)間，減少秋水仙素的毒性[7-8]。

浸根法是指用秋水仙素浸泡單倍體根的方法?？稍谟籽科诤陀酌缙谶M(jìn)行。將植株從土壤中拔出來(lái)后，洗凈根部泥土，將其浸泡在秋水仙素溶液中一段時(shí)間后，流水洗凈根部的藥業(yè)液后，再將其種植于大田中。但是，該方法耗費(fèi)的藥劑量大，成本較高，同時(shí)涉及到育苗、處理、移栽等多個(gè)環(huán)節(jié)，幼苗會(huì)受到毒性和移栽損傷的雙重影響，因此其成活率較低[9-12]。

浸芽法指用秋水仙素浸泡幼芽的方法，當(dāng)玉米單倍體幼芽約2 cm時(shí)，削掉部分頂端浸泡于秋水仙素溶液一段時(shí)間后移栽到育苗盤(pán)中，直至4寠5片葉片時(shí)移栽到大田。但是，該方法由于整個(gè)幼芽均在秋水仙素溶液中，幼芽和幼苗根部均吸收了大量的秋水仙素溶液，緩苗所耗費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，易于造成大量的幼苗死亡。此外，該方法處理程序比較復(fù)雜，相對(duì)較為精細(xì)[13]。

針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法是用注射器將適宜濃度的秋水仙素直接注射到植株的生長(zhǎng)點(diǎn)處。一般是在玉米單倍體植株在6寠7葉片時(shí)在植株莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)注射秋水仙素溶液。該方法不需要育苗和移栽，可極大地避免因育苗和移栽帶來(lái)的幼苗死亡，同時(shí)，

6寠7葉片時(shí)幼苗相對(duì)茁壯，緩苗期大大縮短，成活率較高，加倍率也相對(duì)較高。但是，優(yōu)于單倍體幼苗大小不一，很難保證針刺注射時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)化處理，同時(shí)此時(shí)植株矮小，操作人員難以長(zhǎng)時(shí)間完成大量處理[14-16]。

滴注心葉法是將單倍體幼苗移栽于營(yíng)養(yǎng)皿后，將配比好的秋水仙素溶液滴注于玉米單倍體幼苗的心葉內(nèi)，緩苗處理后移栽大田進(jìn)行精細(xì)管理。該階段一般為單倍體植株生長(zhǎng)到三葉期和五葉期時(shí)。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)秋水仙素用于玉米單倍體加倍的濃度、方法進(jìn)行了比對(duì)研究。慈佳賓等[17]采用不同濃度的秋水仙素分別用浸根法、浸芽法、滴心葉法和針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法對(duì)玉米單倍體加倍效果進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，浸根法處理后玉米單倍體植株的成活率、散粉率、結(jié)實(shí)率都較低；浸芽法處理后成活率可達(dá)58.4%寠78.6%，但散粉率較低，僅可達(dá)3.1%寠10.8%，結(jié)實(shí)率僅1.1%寠3.1%；滴心葉法0.4 mg/mL處理后，玉米單倍體植株的成活率、散粉率、結(jié)實(shí)率分別可達(dá)52.2%、28.9%、11.1%；針刺生長(zhǎng)點(diǎn)法0.6 mg/mL處理后，玉米單倍體植株的成活率、散粉率、結(jié)實(shí)率分別可達(dá)59.6%、45.9%、15.2%，該方法及劑量最優(yōu)。

2.2 除草劑加倍法

利用秋水仙素對(duì)玉米單倍體進(jìn)行加倍處理，雖然可極大地提高加倍率，但其毒性較大，易于對(duì)單倍體植株和操作人員造成損害。因此，尋找具有秋水仙素功能的替代品成為重要任務(wù)。目前，已篩選出一些具有類(lèi)似功能的抗微管除草劑代替，如氟樂(lè)靈、拿草特、甲基胺草磷等。已有研究顯示，部分除草劑的加倍效率不但明顯高過(guò)秋水仙素，還易于降解，不會(huì)導(dǎo)致對(duì)人體和土地的毒害。慈佳賓等[18-19]采用氟樂(lè)靈、拿草特2種抗微管除草劑為試驗(yàn)材料，以秋水仙素為對(duì)照，在不同部位、不同處理時(shí)間和不同濃度條件下對(duì)玉米單倍體的加倍效果進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用浸種法進(jìn)行處理時(shí)，氟樂(lè)靈濃度為80μmol/L處理20 h其加倍率最高可達(dá)到35.7%；采用浸芽法進(jìn)行處理時(shí)，拿草特濃度為60μmol/L處理24 h其加倍率最高可達(dá)24.8%；采用浸根法進(jìn)行處理時(shí)，氟樂(lè)靈濃度為40μmol/L處理15 h其加倍率最高可達(dá)到16.8%?；輫?guó)強(qiáng)等[10]采用甲基胺草磷、炔苯酰草胺、氟樂(lè)靈等3種除草劑分別對(duì)先玉335、中農(nóng)大4號(hào)、8607暳8609等3種單倍體植株進(jìn)行加倍，結(jié)果顯示，甲基胺草磷在80 μmol/L對(duì)先玉335、中農(nóng)大4號(hào)、8607暳8609的加倍率最高，分別達(dá)到26.32%、22.02%、19.40%；炔苯酰草胺在80 μmol/L對(duì)先玉335、中農(nóng)大4號(hào)、8607暳8609的加倍率最高，分別達(dá)到20.81%、18.06%、17.50%；氟樂(lè)靈在40 μmol/L對(duì)先玉335、中農(nóng)大4號(hào)、8607暳8609的加倍率最高，分別達(dá)到17.61%、15.22%、14.05%。

2.3 玉米單倍體加倍的環(huán)境影響

在長(zhǎng)期的研究過(guò)程中，眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，對(duì)于來(lái)源于同一基礎(chǔ)材料的玉米單倍體，采用同一方法、同一濃度、同一管理模式的方法進(jìn)行加倍處理后，不同地域種植的玉米單倍體的加倍率差異顯著，推測(cè)不同種植環(huán)境對(duì)玉米單倍體加倍具有重要影響。段民孝等[20]于2010年在北京昌平（春季）、北京順義（春季）、甘肅張掖（春季）、海南南濱基地（冬季）、海南梅西基地（冬季）針對(duì)來(lái)源于WLIPT的玉米單倍體加倍情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在采用同樣方法、同樣管理模式下，甘肅張掖春季播種的效果最佳，授粉率和結(jié)實(shí)株率分別達(dá)到19.69%和7.43%。姜龍等[21]研究結(jié)果顯示，海南冬季進(jìn)行單倍體誘導(dǎo)，其加倍效率顯著高于北京和長(zhǎng)春等地。

2.4 玉米單倍體加倍的遺傳背景影響

已有的系列研究顯示，玉米單倍體加倍效率除與加倍誘導(dǎo)劑、加倍方法、環(huán)境因素密切相關(guān)外，還與基礎(chǔ)材料的基因型有較大關(guān)聯(lián)。丁照華[22]等研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型基礎(chǔ)材料間單倍體誘導(dǎo)率差異顯著，其誘導(dǎo)效率與基礎(chǔ)材料的基因型有一定關(guān)聯(lián)；相同雜交模式的基礎(chǔ)材料間誘導(dǎo)率變化也較大， 雜交模式間誘導(dǎo)率均值差異不顯著；具有相同親本的基礎(chǔ)材料誘導(dǎo)率變化較大，組間差異不顯著。誘導(dǎo)率大小受基因互作等多因素影響。

2.5 玉米單倍體加倍機(jī)理

長(zhǎng)期以來(lái)，科學(xué)家們對(duì)單倍體植株的加倍機(jī)理進(jìn)行了長(zhǎng)期研究，目前認(rèn)為其加倍機(jī)理可從2個(gè)方面來(lái)進(jìn)行解釋。

2.5.1 干擾玉米單倍體的紡錘體形成

目前染色體加倍使用的化學(xué)藥劑主要有秋水仙素和部分除草劑。秋水仙素誘導(dǎo)加倍的機(jī)制與微管、著絲粒的結(jié)構(gòu)和特性有關(guān)，秋水仙素可與β微管蛋白肽鏈中第201位的半胱氨酸結(jié)合，導(dǎo)致原有的α微管與β微管進(jìn)行解聚，進(jìn)而干擾微管中α微管與β微管的正常聚合，進(jìn)而破壞了紡錘體形成，終止了細(xì)胞分裂，不能一分為二，最終生成了雙倍染色體數(shù)目的細(xì)胞。

2.5.2 倍性效應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控

單倍體植株經(jīng)加倍處理后，受微管蛋白解聚等影響，大量基因出現(xiàn)了差異化表達(dá)和甲基化修飾，部分基因表現(xiàn)為被激活或沉默。張紅宇等[23]對(duì)水稻的單倍體植株和雙倍體植株進(jìn)行了全基因組甲基化位點(diǎn)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)被激活變化和沉默變化的占據(jù)了基因組表達(dá)的0.61%。Stupar等[24]研究發(fā)現(xiàn)，水稻葉鞘和根尖組織中有10%的基因表達(dá)位點(diǎn)發(fā)生變化。

3 結(jié)語(yǔ)

玉米單倍體加倍技術(shù)雖然經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，相關(guān)成果也有了很大的積累。但總體而言，研究并不深入，絕大部分是針對(duì)某一品類(lèi)玉米采用不同方法、不同加倍試劑的檢測(cè)，總體而言較為粗陋，可視為經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)。對(duì)于環(huán)境因素的研究也過(guò)于簡(jiǎn)陋和宏觀，并未從溫度、濕度、降雨、地力等方面進(jìn)行細(xì)致化試驗(yàn)。同時(shí)，在加倍機(jī)理方面，研究也相對(duì)較小，目前相關(guān)研究多集中在水稻和擬南芥等試驗(yàn)材料上，對(duì)于不同加倍方法的細(xì)致化機(jī)理研究不夠深入，尤其是對(duì)除草劑對(duì)單倍體加倍的內(nèi)在機(jī)制、不同滴注位置的加倍機(jī)理表達(dá)未進(jìn)行細(xì)致研究。最為重要的是，尚未形成固定的標(biāo)準(zhǔn)化流程，導(dǎo)致在大規(guī)模育種過(guò)程中穩(wěn)定性不足，后續(xù)應(yīng)對(duì)其進(jìn)行深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Cauto E G，David L M， Bustamante F O，et al. Identification of haploid maize by flow cytometry morphological and molecular markers[J]. Ciênc agrotec Lavras，2013，37：25-31.

[2] Chalyk S， V Ostrovsky. Comparison of haploid and diploid maize plant with identical genotypes[J]. J Genet Breed，1993，47： 77-80.

[3] Chase S S. Monoploid frequencies in a commerical double cross hybrid maize， and in its component single cross hybrids and inbred lines[J]. Genetics， 1949， 34（3）：328-332.

[4] Chase S S. Monoploids and monoploid-derivatives of maize （Zea mays L.）[J]. Bot Rev， 1969， 35： 117-167.

[5] 楊 巍，任雪嬌，崔學(xué)宇，等.玉米單倍體誘導(dǎo)系JS6-2誘導(dǎo)效果的研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2015，43（7）：89-94.

[6] 徐小煒，董 昕，黎 亮，等. 玉米單倍體誘導(dǎo)系間雜交種評(píng)價(jià)及其雜種優(yōu)勢(shì)分析及其雜交組合選育[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，19（4）：1-6.

[7] 劉 俊，尹曉紅，劉 君，等. 不同加倍方法處理玉米單倍體的加倍效果研究[J]. 玉米科學(xué)，2014，22（4）：8-12.

[8] 才 卓，徐國(guó)良，任 軍，等. 玉米雜交誘導(dǎo)單倍體選育自交系技術(shù)規(guī)范（修訂版）[J]. 玉米科學(xué)，2013，21（2）：1-5.

[9] 季洪強(qiáng)，劉 慧，宋桂良，等. 玉米單倍體誘導(dǎo)與加倍方法研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，46（1）：11-15.

[10] 惠國(guó)強(qiáng)，杜何為，楊小紅，等. 不同除草劑加倍玉米單倍體的效率[J]. 作物學(xué)報(bào)，2012，38（3）：416-422.

[11] 段民孝，趙久然，劉新香，等. 春夏不同播期對(duì)玉米單倍體自然加倍率的影響[J]. 玉米科學(xué)，2011，19（5）：39-42.

[12] 杜何為，戴景瑞，李建生. 玉米單倍體育種研究進(jìn)展[J]. 玉米科學(xué)，2010，18（6）：1-7.

[13] 黎 亮，李浩川，徐小煒，等. 玉米孤雌生殖單倍體加倍技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 玉米科學(xué)， 2010，18（1）：12-14，19.

[14] 韓學(xué)莉，唐祈林，榮廷昭. Stock6雜交誘導(dǎo)的玉米單倍體化學(xué)加倍效果研究[J]. 玉米科學(xué)，2009，17（1）：22-27.

[15] 蔡 泉，曹靖生，史桂榮，等. 幾個(gè)不同來(lái)源玉米單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)效果的研究[J]. 玉米科學(xué)，2012，20（4）：19-21.

[16] 徐國(guó)良，代玉仙，劉曉丹，等. 玉米單倍體誘導(dǎo)率和加倍率研究[J]. 玉米科學(xué)，2012，20（2）：1-5.

[17] 慈佳賓，楊 巍，任雪嬌，等. 玉米單倍體誘導(dǎo)及化學(xué)加倍方法的研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015，36（3）：49-53.

[18] 慈佳賓，楊 巍，崔學(xué)宇，等. 不同生態(tài)條件下玉米單倍體誘導(dǎo)率和加倍率的研究[J]. 玉米科學(xué)，2015，23（1）：63-68.

[19] 慈佳賓，李繼竹，劉振庫(kù)，等. 抗微管除草劑對(duì)玉米單倍體加倍效果研究[J]. 玉米科學(xué)，2012， 20（5）：10-14.

[20] 段民孝，趙久然，劉新香，等. 不同種植地點(diǎn)對(duì)玉米單倍體自然加倍率的影響[J]. 作物雜志，2012（2）：68-70.

[21] 姜 龍，南 楠，慈佳賓，等. 基于DH系的種質(zhì)基礎(chǔ)和秋水仙素濃度對(duì)玉米單倍體加倍效果的研究[J]. 玉米科學(xué)，2015，23（2）：28-32.

[22] 丁照華，王志武，徐立華，等. 玉米單倍體誘導(dǎo)率與玉米遺傳背景相關(guān)研究[J]. 玉米科學(xué)，2014，22（2）：18-21.

[23] 張紅宇，崔曉云，侯飛雪，等. 水稻基因組加倍對(duì)籽粒大小調(diào)控基因表達(dá)的影響[J]. 遺傳，2016，38（12）： 1 102-1 113.

[24] Stupar R M，Bhaskar P B，Yandell B S，et al. Phenotypic and transcriptomic changes associated with potato autopolyploidization[J]. Genetics， 2007， 176（4）： 2 055-2 067.