羅彩云 丁家望 鄭霞霞 周 天 張?jiān)購(gòu)?qiáng)

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科，湖北 宜昌 443003)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是引起心血管事件的病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前更傾向于認(rèn)為AS是一種慢性血管炎癥性疾病〔1〕，血管壁在各種內(nèi)源性及外界刺激下?lián)p傷，多種炎癥因子、免疫細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子相互作用發(fā)揮炎性效應(yīng)，形成慢性炎癥。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子(KLF)4是參與調(diào)控心血管系統(tǒng)的重要轉(zhuǎn)錄因子〔2〕，能通過(guò)不同途徑抑制或激活炎性因子，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞活化、巨噬細(xì)胞極化、平滑肌細(xì)胞(SMC)增殖和遷移，發(fā)揮心血管保護(hù)作用。本文探討KLF4在AS的作用。

1 KLF4的概述

KLFs家族屬于真核生物中含鋅指結(jié)構(gòu)較保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，是生物體內(nèi)一類(lèi)具有重要功能的蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及凋亡等多個(gè)生命活動(dòng)的調(diào)控〔2〕。KLF4是KLFs家族中的一員，在機(jī)體多種組織及細(xì)胞表達(dá)，如血管內(nèi)皮、SMC、巨噬細(xì)胞等。KLF4基因定位于9q31，其cDNA編碼全長(zhǎng)為1 413 bp，編碼由470個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。KLF4具有3個(gè)不同功能的結(jié)構(gòu)域，包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和核定位序列，是其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的基礎(chǔ)。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于羧基末端，主要識(shí)別并結(jié)合與其具有高度親和力的富含GC的DNA序列〔3〕，這是KLF家族其中一個(gè)顯著的特點(diǎn)。KLF4氨基端含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，包括兩個(gè)不同位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域，表明 KLF4具有激活基因轉(zhuǎn)錄和抑制基因轉(zhuǎn)錄雙重效應(yīng)。由于非DNA結(jié)合區(qū)域高度變異，KLF4能與不同靶基因結(jié)合發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。KLF4在細(xì)胞周期或細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，主要是通過(guò)抑制P53的表達(dá)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中的G1/S期和G2/M期〔4〕。

2 KLF4與AS炎癥細(xì)胞的相互作用

KLF4是AS斑塊浸潤(rùn)的SMC、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中的重要轉(zhuǎn)錄因子，在不同細(xì)胞中發(fā)揮著不同的作用，從基因水平上調(diào)控靶基因?qū)榉乐蜛S提高到新水平。

2.1KLF4與SMC表型轉(zhuǎn)化 血管SMC(VSMCs)的表型轉(zhuǎn)化是高血壓、AS和血管再狹窄等血管重塑性疾病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)〔5〕。正常VSMC呈收縮表型，KLF4低表達(dá)，但是，當(dāng)氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)、免疫損傷等AS危險(xiǎn)因素存在時(shí)，SMC向合成型轉(zhuǎn)化，KLF4表達(dá)水平明顯升高〔6〕，這表明KLF4表達(dá)水平的高低與SMC表型有關(guān)。Shankman等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，條件性敲除SMC KLF4基因可抑制SMC表型轉(zhuǎn)化及增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性，免疫沉淀技術(shù)檢測(cè)到SMC有多個(gè)KLF4靶點(diǎn)，而這些靶點(diǎn)可能參與吞噬、凋亡、細(xì)胞遷移及炎癥等多個(gè)過(guò)程，抑制或促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展。由此推斷，VSMC表型的轉(zhuǎn)化受到KLF4信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。

Myocardin是血清反應(yīng)因子(SRF)的轉(zhuǎn)錄激活因子，通過(guò)調(diào)控 CArG-盒依賴(lài)性基因，參與SMC分化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔8〕。Turner等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，Myocardin啟動(dòng)子內(nèi)的上游阻遏區(qū)域(URR)有3個(gè)進(jìn)化保守的KLF4位點(diǎn)，在特定條件下阻遏KLF4與啟動(dòng)子結(jié)合，持續(xù)促進(jìn)Myocardin基因表達(dá)。相反，當(dāng)KLF4過(guò)表達(dá)顯著降低Myocardin mRNA水平，抑制Myocardin對(duì)SMC分化標(biāo)記基因的激活作用。然而，KLF家族中的KLF5或KLF2并不具備這種功能。這表明，KLF4在調(diào)控SMC分化標(biāo)志基因方面可能具有特異性。還有研究發(fā)現(xiàn)，KLF4是一個(gè)直接受過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ蛋白調(diào)控的下游靶因，PPARγ拮抗劑通過(guò)激活A(yù)kt蛋白激酶信號(hào)及抑制KLF4去泛素化來(lái)維持KLF4蛋白的穩(wěn)定表達(dá)，從而影響VSMCs增殖分化〔10〕。

表觀遺傳調(diào)控是判定SMC分化狀態(tài)的一個(gè)重要調(diào)節(jié)方式，尤其是在SMC分化標(biāo)志基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白乙?；揎椀恼{(diào)控。SMC染色質(zhì)結(jié)構(gòu)受到多種因素的影響，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1是一個(gè)強(qiáng)效促 VSMC 分化因子，TGF-β1 通過(guò)介導(dǎo)p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和smad信號(hào)通路促進(jìn)磷酸化KLF4與P300結(jié)合及組蛋白H3乙?；?，從而促進(jìn)SMC標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄〔11，12〕。而視黃酸活化KLF4與TGF-β1 有著類(lèi)似的作用方式〔13〕。促SMC增殖刺激因子血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)-BB誘導(dǎo)KLF4去磷酸化和組蛋白去乙?；?HDAC)2去乙?；瑑烧吲c細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ELK)1協(xié)同作用抑制SMC標(biāo)志基因的表達(dá)〔14〕，這表明，促使組蛋白乙?；囊蛩囟寂c誘導(dǎo)KLF4 表達(dá)有關(guān)，可以推斷，染色質(zhì)重塑的過(guò)程依賴(lài)于KLF4。SMC α-actin標(biāo)志基因組蛋白H4乙?；?，被發(fā)現(xiàn)是HDAC2和HDAC5與KLF4直接交互作用產(chǎn)生〔15〕。這一結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，KLF4 是通過(guò)組蛋白乙酰化修飾抑制SMC分化標(biāo)志基因。研究KLF4與組蛋白乙?；g的關(guān)系，從表觀遺傳學(xué)角度揭示VSMC表型調(diào)節(jié)機(jī)制及分化的新機(jī)制。

MicroRNAs代表控制SMC分化狀態(tài)的另一種表觀遺傳機(jī)制，通過(guò)針對(duì)性降解信使RNA發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后抑制作用。miR-1與KLF4直接結(jié)合調(diào)控胚胎干細(xì)胞向SMC分化〔16〕。KLF4是TGF-β和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)4誘導(dǎo)SMC收縮基因表達(dá)的先決條件，TGF-β和BMP4通過(guò)誘導(dǎo)miRs-143 和miRs-145迅速下調(diào)KLF4表達(dá)〔17〕。此外，KLF4介導(dǎo)miR-15a阻止細(xì)胞周期進(jìn)程，減少內(nèi)皮細(xì)胞和VSMC細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)〔18〕。綜上所述，轉(zhuǎn)錄因子 KLF4對(duì)維持VSMC內(nèi)環(huán)境的平衡是必不可少的。

2.2KLF4與巨噬細(xì)胞 內(nèi)皮下的巨噬細(xì)胞是泡沫細(xì)胞的主要來(lái)源。巨噬細(xì)胞不同亞型極化及其作用是近年來(lái)AS病理研究的熱點(diǎn)，巨噬細(xì)胞主要分為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞M1和替代性活化的巨噬細(xì)胞M2兩個(gè)亞型。Sharma等〔19〕發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞極化依賴(lài)于轉(zhuǎn)錄因子KLF4的調(diào)控。骨髓細(xì)胞或巨噬細(xì)胞KLF4缺失的APOE-/-小鼠較APOE-/-小鼠血脂明顯升高，IL-6和IL-1β促炎因子表達(dá)水平升高，AS斑塊面積增加。提示KLF4促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型分化，負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答。這表明，KLF4具有抑制血管炎癥和抗AS的作用。Karpurapu等〔20〕研究者運(yùn)用非增殖性PU.1誘導(dǎo)的髓系祖細(xì)胞和分化的骨髓巨噬細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)PU.1能夠特異性與去甲基化的KLF4啟動(dòng)子結(jié)合，巨噬細(xì)胞分化標(biāo)志F4/80表達(dá)增強(qiáng)。相反，敲除胞嘧啶核苷脫氨酶(AICDA)基因可抑制KLF4啟動(dòng)子去甲基化，PU.1與KLF4親和力明顯下降。結(jié)果表明，KLF4啟動(dòng)子通過(guò)去甲基化修飾調(diào)控巨噬細(xì)胞的活化，可能是通過(guò)胞嘧啶核苷脫氨酶發(fā)揮作用。

巨噬細(xì)胞是促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定的重要炎癥細(xì)胞，微環(huán)境的變化會(huì)影響巨噬細(xì)胞活化。干擾素(IFN)-γ、脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子(TNF)-α下調(diào)KLF4表達(dá)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，降低斑塊穩(wěn)定性，而抗炎因子TGF-β1作用則相反〔21〕。然而，KLF4與TGF-β1相互作用的分子機(jī)制尚不清楚。Feinberg等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)，KLF4與核因子(NF)-κB家族P65共同作用于誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)啟動(dòng)子，通過(guò)拮抗信號(hào)蛋白Smad3羧基端激活劑p300/CBP 抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路。由此證明，KLF4在調(diào)控促炎癥反應(yīng)巨噬細(xì)胞發(fā)揮重要作用，同時(shí)可以作為調(diào)控 TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的靶點(diǎn)。此外，其他研究從促進(jìn)脂質(zhì)代謝方面闡述了KLF4在巨噬細(xì)胞中的意義。 Stavri等〔22〕發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化時(shí)，高表達(dá)的KLF4與CAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)協(xié)同激活載脂蛋白(APO)E基因啟動(dòng)子，抑制斑塊的進(jìn)展并減少并發(fā)癥的發(fā)生。提示以KLF4為靶點(diǎn)調(diào)控巨噬細(xì)胞APOE基因表達(dá)，改善脂質(zhì)代謝內(nèi)環(huán)境，將為抗AS治療提供更有效的方式。

2.3KLF4與血管內(nèi)皮細(xì)胞 KLF4表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和胞核，在調(diào)節(jié)血管生物學(xué)功能中起重要作用。缺失KLF4的內(nèi)皮細(xì)胞或造血細(xì)胞可上調(diào)黏附分子的表達(dá)，促使AS斑塊巨噬細(xì)胞聚集，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞以旁分泌的方式促進(jìn)SMC增殖，誘導(dǎo)損傷的新生內(nèi)膜形成〔23〕。KLF4高表達(dá)可下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)1的表達(dá)，并能抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)的表達(dá)并能減少促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，具有抗炎、抗血栓作用〔24〕。研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用siRNA技術(shù)沉默 KLF4基因的小鼠較控制組血管內(nèi)皮鈣黏蛋白的表達(dá)減弱，內(nèi)皮細(xì)胞通透性增強(qiáng)，小鼠更易出現(xiàn)肝損傷、肺水腫〔25〕。結(jié)果表明，KLF4具有維持內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的作用。他汀類(lèi)藥物上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞抗AS基因與KLF家族轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)〔26〕。為明確基因調(diào)控的機(jī)制，研究者對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)給予他汀類(lèi)藥物處理后進(jìn)行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)KLF4是高度誘導(dǎo)基因，靶點(diǎn)則是位于其近端啟動(dòng)子區(qū)域的肌細(xì)胞增強(qiáng)因子(MEF)2。由此可見(jiàn)，KLF4將是他汀類(lèi)藥物調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄因子。

NF-κB是調(diào)控炎癥、凋亡、自噬過(guò)程的中樞，選擇性抑制SMC NF-κB信號(hào)通路，能減弱SMC表型轉(zhuǎn)化和新生內(nèi)膜形成。并且，NF-κB與KLF4同時(shí)參與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附因子、巨噬細(xì)胞遷移的調(diào)控，但是兩者之間的作用方式具有細(xì)胞選擇性，如在SMC中兩者具有協(xié)同作用，而在內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相互拮抗〔27〕。

2.4KLF4與淋巴細(xì)胞 TH17是新近發(fā)現(xiàn)的一種CD4+細(xì)胞亞型，在炎癥性疾病、自身免疫性疾病扮演重要作用。初始CD4+細(xì)胞向其他T細(xì)胞亞型分化受到特異性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。研究者〔28〕發(fā)現(xiàn)，KLF4能與TH17 細(xì)胞啟動(dòng)子結(jié)合，表明KLF4能直接調(diào)控TH17細(xì)胞分化。并且，在敲除KLF4基因小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，調(diào)控TH7細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤核受體(ROR)yt表達(dá)上調(diào)，這表明KLF4與RORyt兩種轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)TH17細(xì)胞分化方面分別發(fā)揮作用。

3 展 望

AS是多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的慢性血管炎癥性疾病，其中斑塊的形成是AS的標(biāo)志。如何減緩斑塊的形成和破裂，減少并發(fā)癥的發(fā)生仍是目前最大的難題。大量研究表明，KLF4具有調(diào)節(jié)SMC增殖和分化、抑制巨噬細(xì)胞發(fā)揮炎癥效應(yīng)、維持內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能等多種生物學(xué)效應(yīng)，從而減輕炎癥和增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性，以KLF4為靶點(diǎn)將會(huì)為治療AS帶來(lái)新的曙光。但是，KLF4調(diào)控AS斑塊浸潤(rùn)的不同細(xì)胞的分子機(jī)制及是否能誘導(dǎo)SMC向其他細(xì)胞表型定向轉(zhuǎn)化等一系列問(wèn)題仍需大量的研究驗(yàn)證。

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