張?zhí)煊?陳穎

先天性外中耳畸形又稱小耳畸形，是耳鼻喉科常見(jiàn)的先天性疾患之一，表現(xiàn)為耳郭大小、形態(tài)、位置和結(jié)構(gòu)的先天異常，多合并外耳道狹窄、閉鎖以及錘砧關(guān)節(jié)融合、鐙骨缺失、聽(tīng)骨鏈固定、中耳腔發(fā)育不良等中耳畸形。其發(fā)病率為0.83/萬(wàn)～17.4/萬(wàn)不等，全球發(fā)病率約為2.06/萬(wàn)，其中我國(guó)的發(fā)病率為1.4/萬(wàn)[1]。先天性外中耳畸形患者可表現(xiàn)為單一的臨床癥狀，也可以是綜合征的耳部表現(xiàn)。

先天性外中耳畸形發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，本課題組流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)孕期流感樣綜合征、自然流產(chǎn)史、陰道炎、宮頸炎等炎癥感染和油漆、殺蟲(chóng)劑等有毒化學(xué)物質(zhì)暴露等因素是該病的危險(xiǎn)因素[2]，而遺傳因素在該疾病的發(fā)生中也有重要作用。流行病學(xué)調(diào)查提示4%～8%的先天性外中耳畸形患者有家族史[2, 3]；先天性外中耳畸形在同卵雙胞胎中的發(fā)病率(38.5%)遠(yuǎn)大于異卵雙胞胎(4.5%)[4]。由于外中耳胚胎來(lái)源于第一、二腮弓的內(nèi)、中、外胚層及神經(jīng)嵴細(xì)胞[5]，與腮弓發(fā)育、神經(jīng)嵴細(xì)胞分化發(fā)育及外中耳形態(tài)發(fā)生過(guò)程中相關(guān)的基因，如：同源盒基因家族成員(HOXA1、HOXA2等)、SIX2、EYA、TBX1、TCOF1等基因的突變可導(dǎo)致不同的外中耳畸形綜合征[6]。本文將介紹先天性外中耳畸形致病基因的識(shí)別及功能研究現(xiàn)狀。

1 染色體異常所致先天性外中耳畸形

染色體片段的增加、缺失或易位可導(dǎo)致先天性外中耳畸形的發(fā)生[7]，即便是既往認(rèn)識(shí)的良性突變，也可致??；Balikova等報(bào)告了一個(gè)常染色顯性遺傳小耳畸形綜合征家系，該家系患者還合并鼻淚管閉鎖、虹膜缺損癥狀[8]，4p16上增加的5個(gè)串聯(lián)拷貝是致病遺傳變異，增加的串聯(lián)拷貝既往報(bào)道為人群良性拷貝數(shù)變異區(qū)。

染色體異常所致先天性外中耳畸形的機(jī)制目前尚不完全明確，F(xiàn)eenstra等[9]對(duì)18 q缺失綜合征的研究解釋了染色體缺失所致外中耳畸形的可能機(jī)制之一。18 q缺失綜合征指的是由于18號(hào)染色體長(zhǎng)臂片段缺失所致的身材矮小、智力發(fā)育異常、肌張力減退、聽(tīng)力損失、足部畸形等先天異常癥候群。Feenstra等注意到18 q缺失綜合征患者中耳腔狹窄發(fā)生率高，因而選取了4例合并雙側(cè)外耳道狹窄的18 q缺失綜合征患者進(jìn)行SNP-array分析，發(fā)現(xiàn)患者染色體中有459 kb重疊缺失片段；該片段包含推測(cè)的C180rf62蛋白編碼信息和已知TSHZ1基因，其中TSHZ1基因(teashirt zinc finger homeo Box 1)是teashirt鋅指蛋白家族成員，在小鼠胚胎中廣泛表達(dá)，TSHZ1基因敲除小鼠模型中，該基因被證實(shí)與外中耳發(fā)育相關(guān)，小鼠TSHZ1基因功能缺失時(shí)，可以導(dǎo)致中耳畸形；TSHZ1基因完全失活小鼠可導(dǎo)致新生鼠死亡，多發(fā)發(fā)育障礙，包括嚴(yán)重的中耳畸形，與單純外耳道狹窄患者表型相似。進(jìn)一步擴(kuò)大驗(yàn)證中，作者選擇11例雙側(cè)耳道狹窄且耳郭正?；颊哌M(jìn)行TSHZ1基因雙向Sanger測(cè)序，發(fā)現(xiàn)4例患者及其中1例患者的無(wú)癥狀家屬攜帶該基因雜合突變；證實(shí)了TSHZ1是導(dǎo)致單純外耳道狹窄的候選基因，且不完全外顯[10]。對(duì)TSHZ1基因突變所致外耳道狹窄的研究提示，染色體片段缺失所致外中耳發(fā)育所需基因的半定量不足是該疾病的發(fā)生機(jī)制之一，為將來(lái)新致病基因的識(shí)別、表型-基因型研究提供了新思路。

2 單基因所致外中耳畸形

經(jīng)典遺傳學(xué)研究方法，如：家系連鎖分析、細(xì)胞基因?qū)W等方法發(fā)現(xiàn)了Treacher Collins綜合征、Townes-Brocks綜合征等耳畸形綜合征的致病基因[11, 12]；近年來(lái)由于全基因組測(cè)序、全外顯子測(cè)序等高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析的應(yīng)用，先天性外中耳畸形綜合征致病基因的識(shí)別進(jìn)展諸多，目前已有超過(guò)十余種耳畸形綜合征，如：Nager綜合征、LAMM綜合征等的致病基因被發(fā)現(xiàn)，Miller綜合征為顱面畸形合并軸后性肢體畸形的耳畸形綜合征，是首個(gè)利用全外顯子測(cè)序技術(shù)識(shí)別致病基因的孟德?tīng)栠z傳疾病[13]?；蚬こ?、基因編輯技術(shù)的發(fā)展使得疾病的動(dòng)物模型更易獲得，在小鼠、斑馬魚(yú)、豬等轉(zhuǎn)基因或基因敲除動(dòng)物中，可模擬出人類耳畸形疾病的表型，促進(jìn)了對(duì)基因功能的認(rèn)識(shí)，有助于對(duì)疾病的發(fā)生機(jī)制的研究和疾病的預(yù)防。

2.1TCOF1基因突變陰性的Treacher Collins綜合征(Treacher Collins syndrome,TCS) Treacher Collin綜合征患者中，約63%～93%攜帶TCOF1基因突變，仍有部分患者不能明確致病基因，提示了該疾病的遺傳異質(zhì)性[14, 15]。Dauwerse等[16]通過(guò)全基因組拷貝數(shù)分析發(fā)現(xiàn)一例TCOF1基因突變陰性的Treacher Collin綜合征患兒攜帶染色體13q12.2區(qū)間的缺失，該缺失片段包含了POLR1D基因全部序列和LNX2基因的第一外顯子，在810例TCOF1基因突變陰性的TCS患者中行POLR1D和LNX2測(cè)序，發(fā)現(xiàn)一例男性患兒攜帶POLR1D基因的雜合無(wú)義突變；擴(kuò)大樣本驗(yàn)證對(duì)242例無(wú)TCOF1基因突變的TCS患者進(jìn)行POLR1D測(cè)序，發(fā)現(xiàn)20例患者攜帶該基因的10種雜合無(wú)義突變和7種錯(cuò)義突變，確定了POLR1D是TCS的致病基因；由于POLR1C與POLR1D基因功能相互聯(lián)系，進(jìn)一步對(duì)252例TCS患者的POLR1C基因進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)3例家系患者攜帶該基因致病性突變，確定了POLR1DPOLR1C為TCS的致病基因[16]。POLR1D突變可引起常染色體顯性或隱性遺傳的表型，而POLR1C突變則導(dǎo)致常染色體隱性遺傳的表型[17]。動(dòng)物模型研究中發(fā)現(xiàn)POLR1D、POLR1C在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育期的顱面部組織高表達(dá)，polr1c-/-或polr1d-/-的斑馬魚(yú)突變體中核糖體生化生成減少，導(dǎo)致神經(jīng)上皮死亡及神經(jīng)嵴細(xì)胞缺陷，引起顱面軟骨發(fā)育異常，第一、第二腮弓體積的減少，最終導(dǎo)致斑馬魚(yú)突變體顱面發(fā)育異常，該異常與TCS患者面容相吻合。該異常的細(xì)胞死亡是tp53途徑依賴的，通過(guò)抑制tp53功能可減少突變斑馬魚(yú)的畸形程度，為TCS的預(yù)防和治療提供了新的思路[18]。

2.2Meier-Gorlin綜合征(Meier-Gorlin syndrome，MGS) 即耳-髕骨-矮小綜合征，是一種先天性小耳畸形合并髕骨缺失或發(fā)育不良、發(fā)育遲緩的罕見(jiàn)綜合征。約94%的MGS患者可有不同程度的小耳畸形，是該綜合征最常見(jiàn)的表型[19]。MGS目前已知有8個(gè)致病基因，分別為ORC1、ORC4、ORC6、CDT1，CDC6、CDC45L、MCM5和GMNN基因，除GMNN引起常染色體顯性遺傳表型外，其余基因均導(dǎo)致常染色體隱性遺傳疾病[20～25]。ORC1、ORC4、ORC6均為起始識(shí)別復(fù)合物(origin recognition complex，ORC)1～6亞基的編碼基因，在真核細(xì)胞G1相期間，首先形成起始識(shí)別復(fù)合物并召集CDC6、CDT1等蛋白，形成復(fù)制前復(fù)合體(pre-replication complex，preRC)，從而加載微小染色體維持解旋酶蛋白2～7(minichromosome maintenance helicase，MCM helicase)至復(fù)制起始位點(diǎn)，進(jìn)而允許DNA的復(fù)制[21]；CDC45在DNA復(fù)制過(guò)程，與MCM解旋酶轉(zhuǎn)化為激活態(tài)，參與DNA解旋[23]。GMNN編碼的Geminin蛋白則是通過(guò)調(diào)控CDT1發(fā)揮抑制DNA復(fù)制[24]的作用。ORC6基因點(diǎn)突變的果蠅在第三齡幼蟲(chóng)階段死于DNA復(fù)制缺陷和異常染色體的生成，即便通過(guò)在突變體中過(guò)表達(dá)ORC6蛋白，存活的果蠅仍較正常體有缺陷。而CDC6突變的斑馬魚(yú)則會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育遲滯，生育能力減低，與MGS患者表型一致[26]。

2.3HOXA2基因所致耳畸形 HOXA2突變可引起常染色體隱性遺傳的耳畸形綜合征，患者癥狀除外耳畸形、耳道狹窄及不同程度中耳畸形外，尚可合并腭裂[7]；也有報(bào)道指出HOXA2無(wú)義突變可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳的非綜合征型外中耳畸形[27]。目前HOXA2在人群中的致病突變報(bào)道較少，而動(dòng)物模型則很好的揭示了HOXA2在外中耳發(fā)育中的關(guān)鍵作用及突變后致畸的機(jī)制。HOXA2基因功能與外耳的形態(tài)發(fā)生密切相關(guān)，如：在小鼠胚胎E11.5前失活，可導(dǎo)致無(wú)耳畸形，而在E12.5～13.5日失活，則導(dǎo)致小耳畸形；Minoux等[28]利用譜系追蹤揭示了小鼠的耳郭來(lái)源與HOXA2表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)嵴細(xì)胞(neuralcrestcell)，提示耳郭來(lái)源于第二腮弓，而異位表達(dá)于第一腮弓的HOXA2基因可誘導(dǎo)形成鏡像的耳郭和外耳道。其機(jī)制是HOXA2基因可通過(guò)與Bmp4、Bmp5的非編碼區(qū)結(jié)合，調(diào)控BMP通路，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)對(duì)耳郭的形態(tài)發(fā)生起關(guān)鍵作用。

2.4下頜面骨發(fā)育不全Guion-Almeida型(Mandibulofacial dysostosis, Guion-Almeida type; MFDGA) Guion-Almeida等曾報(bào)道了顱面發(fā)育不全合并小頭畸形、生長(zhǎng)發(fā)育和言語(yǔ)發(fā)育遲滯的4例患兒，并提出該表型是全新的顱面發(fā)育不全綜合征的亞型[29，30]。2012年Lines等[29]利用全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)12例顱面畸形(其中11例有小耳畸形)合并小頭畸形患者的致病基因EFTUD2，該患者隊(duì)列中包含Guion-Almeida報(bào)道的2例患者。更多的突變報(bào)道和表型關(guān)聯(lián)分析則指出EFTUD2基因?qū)е碌南骂M面骨發(fā)育不全的最易外顯的表型(>80%)為發(fā)育遲緩、小頭畸形、顴弓發(fā)育不良、小耳畸形及聽(tīng)力損失，食道狹窄發(fā)生概率雖僅為27%，但是該綜合征與其他顱面畸形的特征表型有區(qū)別[30]。Eftud2fn10a斑馬魚(yú)中EFTUD2的無(wú)義突變導(dǎo)致中樞神經(jīng)及脊柱神經(jīng)元祖細(xì)胞的大量凋亡，其機(jī)制是無(wú)義突變的EFTUD2基因引起轉(zhuǎn)錄水平上RNA剪接異常，出現(xiàn)大量?jī)?nèi)含子保留(intron retaining)和外顯子跳讀(exon-skipping)的轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而導(dǎo)致錯(cuò)誤的RNA降解，激發(fā)p53通路導(dǎo)致斑馬魚(yú)表型的異常，解釋了EFTUD2基因突變導(dǎo)致的MFDGA患者中出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲滯的原因[31]。

2.5眼耳綜合征(oculo-auricular syndrome，OAS) 為HMX1基因(H6 family homeobox 1 gene) 缺陷引起的先天性眼部、耳部發(fā)育異常?；颊呖捎邢忍煨园變?nèi)障、眼球震顫、虹膜后黏連、小眼、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜缺損；耳部表型可有耳郭位置低垂、外耳道狹窄、耳垂裂、耳郭形態(tài)異常等[32～34]。HMX1基因錯(cuò)義、插入突變可導(dǎo)致鼠、牛的耳郭形態(tài)、位置異常[35, 36]。HMX1缺失突變小鼠在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Hox-Pbx-Meis 復(fù)合體通過(guò)HMX1基因的保守進(jìn)化區(qū)(evolutionarily conserved region，ECR)作用，調(diào)節(jié)HMX1基因在頭面外側(cè)部的表達(dá)[37]。

3 患者人群中的致病基因篩查研究

先天性外中耳畸形患者中，僅有少部分患者有家族遺傳史，更多為散發(fā)患者；而69.5%患者為單純外中耳畸形；目前明確已知致病基因的多為綜合征型的單基因遺傳疾病。在大宗患者人群中的致病基因篩查，可以為散發(fā)型患者提供更多的致病基因篩查信息。

在先天性外中耳畸形人群中利用直接測(cè)序?qū)σ阎蜻M(jìn)行突變檢測(cè)的結(jié)果欠佳，致病突變檢出率低，且同一突變?cè)谌巳褐兄貜?fù)性低。Monks等[38]對(duì)散發(fā)的單純小耳畸形患者進(jìn)行HOXA2和SIX2基因的突變檢測(cè)，并未發(fā)現(xiàn)致病突變。Hao等[39]對(duì)106例先天性耳畸形患者進(jìn)行GSC、HOXA2 和PRKRA基因的直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)5個(gè)新發(fā)突變，其中包括GSC基因g.994C>T同義突變，該突變?cè)?0例正常對(duì)照者中被檢測(cè)到，考慮為核苷酸多態(tài)性，而首次報(bào)道的HOXA2基因5’UTR區(qū)g.90G>A和g.114A>C生物學(xué)功能尚不明確[39]；Lin等[40]對(duì)181例先天性外中耳畸形患者進(jìn)行PACT基因的測(cè)序，并未發(fā)現(xiàn)散發(fā)或家系患者攜帶該基因的致病突變。這些研究結(jié)果提示先天性外中耳畸形的發(fā)病機(jī)制中遺傳學(xué)病因僅能解釋部分患者的發(fā)病，且致病基因具有異質(zhì)性。

利用高通量測(cè)序篩查耳畸形人群遺傳信息的工作中，Zhang等[41]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析對(duì)939例半面短小患者和2 012例健康人群進(jìn)行90萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)檢測(cè)，篩選出顯著相關(guān)的位點(diǎn)8個(gè)，可能相關(guān)位點(diǎn)5個(gè)，該13個(gè)位點(diǎn)所在基因分別是ROBO1、GATA3、GBX2、FGF3、NRP2、EDNRB、SHROOM3、SEMA7A、PLCD3、KLF12和EPAS1，與神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育和血管生成密切相關(guān)，為先天性外中耳畸形致病基因提供了豐富的遺傳學(xué)資料。

4 未來(lái)研究展望

先天性外中耳畸形的遺傳學(xué)致病機(jī)制研究對(duì)該疾病的預(yù)防、治療有重要作用，可能也會(huì)使對(duì)外中耳發(fā)育、中耳疾病的發(fā)生發(fā)展得到更深入認(rèn)識(shí)。但是，目前仍面臨諸多問(wèn)題：①外中耳畸形的發(fā)生具有不同外顯率，受累程度差異大，合并畸形種類多，表型復(fù)雜；②外中耳發(fā)育的相關(guān)研究仍不夠充分，對(duì)突變檢測(cè)中所識(shí)別突變的功能難以解釋；③耳畸形的致病基因具有異質(zhì)性，其發(fā)病可能是單基因或多基因引起；在未來(lái)的工作中，利用連鎖分析和各類測(cè)序手段進(jìn)行耳畸形患者的遺傳學(xué)信息檢測(cè)過(guò)程中，仍需要對(duì)耳畸形臨床表型進(jìn)行細(xì)化；同時(shí)，對(duì)外中耳發(fā)育、相關(guān)基因調(diào)控、各類信號(hào)通路的研究，也將對(duì)先天性外中耳畸形致病機(jī)制的研究有重大意義。