孫明潔，董國英，張雪竹，胡桂學*

(1.吉林農業(yè)大學 動物科學技術學院，長春 130118; 2.北京師范大學 全球變化與地球系統(tǒng)科學研究院，北京100875)

犬細小病毒(Canine Parvovirus, CPV)是一種引起犬科和多種野生食肉動物的接觸性傳染病的病原體，以胃腸炎和心肌炎為主要臨床癥狀。其中2～4月齡的幼犬感染風險最大，發(fā)病率和致死率均可達到70%左右。CPV為細小病毒科，細小病毒屬，基因組全長5.3 kb，是自主復制的線性單鏈負股DNA病毒，基因遺傳進化關系顯示CPV與貓細小病毒(FPLV)、水貂腸炎病毒(MEV)和藍狐細小病毒(BFPV)親緣關系較近[1]。CPV有兩個開放閱讀框(ORF)1和2，其中ORF1編碼兩個非結構蛋白NS1和NS2，ORF2由VP1和VP2組成。VP2蛋白是病毒衣殼的主要成分，在抗原性與宿主范圍等方面起著重大作用[2]。1978年CPV被首次發(fā)現(xiàn)，至今近40年的時間，基因和抗原不斷發(fā)生變異，相繼出現(xiàn)了CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c等變異毒株[3]。CPV VP2極易發(fā)生變異，CPV-2抗原性變體(CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c)相比CPV-2在VP2蛋白上有4至5個氨基酸殘基差異。這種新變異毒株在抗原性和基因序列上發(fā)生明顯變化，從而使CPV的檢測方法發(fā)生了改變。因此對CPV的實驗室診斷和臨床診斷的新型檢測方法進行綜述，以期為CPV診斷提供有效的檢測技術。

1 分子生物學檢測

1.1 傳統(tǒng)PCR技術 聚合酶鏈式反應(PCR)作為第一代PCR技術一直延續(xù)至今，已成為核酸診斷的“金標準”被廣泛應用到病原體檢測等方面[4]。PCR檢測技術以靈敏、特異和易操作等特點，作為CPV檢測的主要手段被實驗室應用。劉雪燕等將PCR擴增技術和細胞定位技術相結合建立了一種F81細胞CPV原位PCR檢測方法，并應用該方法與常規(guī)免疫組化方法進行比較分析，結果顯示原位PCR陽性率較高且更精準的表明病毒感染細胞的位置及程度。然而，原位PCR方法并不能大范圍的推廣，為了實現(xiàn)商品化應用，劉忠華等學者在2002年，設計一對CPV特異引物并開發(fā)了CPV PCR診斷試劑盒，最低可檢測10 ng CPV DNA，并實現(xiàn)商品化應用。隨著自然選擇與疫苗免疫的驅動，CPV基因不斷的變異導致當前全世界普遍流行著4種(CPV-2、CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c)抗原類型毒株。因此傳統(tǒng)PCR檢測方法已不能滿足對這4種抗原類型的精準鑒定，因此有學者陸續(xù)建立多種PCR優(yōu)化改進方法。Meggiolaro建立了一種MT-PCR方法檢測糞便中的CPV-2毒株，該方法高度敏感可檢測較低病毒水平的核酸，但是通過拷貝數(shù)或Ct值區(qū)別CPV-2疫苗株或野生毒株較難實現(xiàn)[5]。為此，有學者為了實現(xiàn)多種病原的快速檢測，開發(fā)了一種MT-PCR檢測方法，該方法可檢測CPV、貓冠狀病毒、犬瘟熱、犬冠狀病毒、沙門氏菌、賈第蟲等12種病原體，在2014年被應用到悉尼大學獸醫(yī)病理診斷部對小型動物病原體進行檢測[6]。有研究也建立了一種三重PCR/RT-PCR同時檢測CDV、CPV和CaKoV，不僅具有較高的特異性和敏感性且可同時對易感染犬的主要病毒進行鑒定，這種方法避免了材料的浪費，降低了污染造成的假陽性結果[7]。為了實現(xiàn)對CPV臨床現(xiàn)場快速檢測的要求，有學者建立了一種iiPCR檢測方法可滿足快速準確的PON檢測，并且iiPCR 檢測方法的敏感性可與實驗室內Real-Time PCR相同，90 min即可獲得檢測結果，可滿足研究者臨床檢測的需求[8]。雖然不斷的對傳統(tǒng)CPV PCR檢測方法進行優(yōu)化，但是仍不能滿足當前的臨床需求。

1.2 熒光定量PCR(Real-Time PCR，qPCR) qPCR是1996年由美國ABI公司首先開發(fā)的第二代PCR技術，分為染料法(SYBR Green)和探針法(TaqMan)。qPCR不僅特異性、敏感性和重復性都優(yōu)于傳統(tǒng)的PCR，而且探針法可設計多種探針實現(xiàn)多重檢測，可滿足CPV多種亞型的一次鑒別，省時省力被廣泛應用于實驗室檢測。有研究建立了一種CPV多重qPCR檢測方法，該方法可對當前多種CPV亞型毒株進行鑒別診斷，為精準治療提供最有效的檢測結果[9]。曹雪峰等也建立了一種快速準確的檢測方法，即CPV新型原液qPCR檢測方法，此方法可省略核酸提取步驟進行快速qPCR反應，且特異性好，重復性穩(wěn)定，離散程度小，批內及批間變異系數(shù)均不超過1.3%，該方法與核酸qPCR均最低可檢測10 copies/μL, 但是新型原液qPCR方法不僅節(jié)約檢測成本且效率更高[10]。然而，qPCR方法需要昂貴的儀器設備，很難開展大范圍的臨床應用，只可滿足實驗室的檢測及分析。

1.3 環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) LAMP是由日本學者在2000年開發(fā)的一種核酸擴增技術，其通過在靶DNA鏈6個不同區(qū)段設計4條特異引物在鏈置換DNA聚合酶作用下進行擴增反應。該方法特異性高，操作簡單只需恒溫水浴鍋即可在1 h內完成，且只需根據(jù)擴增物的有無即可完成診斷。2010年郭偉開發(fā)了CPV LAMP檢測方法，并在不斷優(yōu)化的過程發(fā)現(xiàn)，鎂離子為8 mmol/L擴增效率最高，特異性好，最低可檢測5.7個拷貝，相比普通PCR敏感100倍[11]。Parthiban曾在2012年建立了可快速現(xiàn)場診斷的CPV LAMP檢測技術，該方法相比普通PCR和巢式PCR更敏感準確，被認為是最具潛力的CPV診斷方法[12]。但是LAMP方法易因污染造成假陽性結果，一直備受爭議。因此有學者在LAMP方法反應體系中加入熒光染料SYBR Green Ⅰ，并利用國內首臺恒溫熒光檢測儀Deaou-308C實現(xiàn)全程封閉檢測，可在63 ℃ 45 min完成檢測，最低敏感度為3.72 copies/μL，并成功應用到大熊貓CPV檢測診斷，具有極高的實際應用價值[13]。盡管許多高效和快捷的CPV檢測方法陸續(xù)應用到臨床檢測試驗中，但是仍面臨著因病毒含量較低而誤判結果。因此有研究者又對LAMP檢測方法進行改進，利用免疫捕獲可濃縮病毒粒子技術建立了CPV IC-LAMP檢測方法，并與ELISA和LFD試驗相結合，檢測的敏感性均為10-1TCID50，并可省略DNA提取步驟，在90 min內即可用肉眼直接判定檢測結果而被廣泛認可[14]。隨著LAMP技術不斷的優(yōu)化改進，使該檢測方法不僅成本低、操作簡便、敏感性高，而且可直接應用于臨床現(xiàn)場檢測，是當前應用于寵物醫(yī)院臨床診斷中最具潛力的檢測方法。

1.4 重組聚合酶擴增反應(Recombinase Polymerase Amplification, RPA) RPA是核酸恒溫擴增技術中的一種新型檢測方法，該方法首先通過能結合單鏈核酸的重組酶與引物形成蛋白-引物復合物并與引物的同源性雙鏈DNA靶標序列進行互補配對，隨后在單鏈結合蛋白的作用下進行DNA鏈交換反應形成穩(wěn)定的DNA單鏈，最終啟動鏈置換DNA聚合酶進行指數(shù)式核酸擴增反應[15]。RPA在37～42 ℃恒溫條件并能在15 min即可完成結果判定，該方法省略了PCR技術中變性、退火和延伸3個變溫步驟，真正實現(xiàn)了便攜式恒溫擴增反應而被稱為可以替代PCR檢測的新技術[16]。RPA在Basic-RPA技術之上又延伸發(fā)展了探針法RPA和側流層析試紙條RPA，實現(xiàn)了用肉眼直觀判定檢測結果的便捷性。Liu等基于CPV VP2基因開發(fā)了一種可視且無需設備的LFS RPA檢測方法，在拳頭內以體熱封閉15 min后，并在5 min內即可在LFS肉眼判定結果。該檢測方法不僅實現(xiàn)了CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c等多種亞型CPV的檢測，且可最低檢測1×102拷貝每個反應，具備了與qPCR的檢測敏感度[17]。Geng等建立了一種基于exo探針的實時RPA CPV-2檢測方法，該方法快速、簡單12 min即可讀取結果且最低可檢測10 拷貝每個反應，實現(xiàn)了在條件限制的野外檢測，為檢疫站、港口和基層獸醫(yī)工作者提供了便攜且高效的CPV-2檢測技術[18]。RPA檢測技術現(xiàn)已廣泛應用于多種病毒檢測，然而因其成本較高還不能大范圍推廣，但是該方法的特異性、敏感性和便攜性都較傳統(tǒng)PCR技術更優(yōu)越，因此該方法將會成為CPV檢測的新標準。

2 免疫學檢測

2.1 血凝及血凝抑制試驗 血凝(HA)及血凝抑制(HI)試驗是免疫學試驗中最簡單且最廉價的檢測方法，基于某類病毒或病毒的血凝素能選擇的與動物紅細胞發(fā)生凝集的現(xiàn)象，而HI試驗是利用特異性抗體與病毒結合，使其失去凝集紅細胞能力，抑制血凝發(fā)生的試驗。該實驗直觀可靠，已廣泛應用于禽流感病毒、新城疫病毒和犬細小病毒等檢測試驗中。CPV可凝集豬、倉鼠、恒河猴、貓和馬等紅細胞，并與醛化的豬紅細胞凝集更顯著。通過HA和HI試驗同時可反映病毒的血凝滴度及犬血清中抗體的血凝抑制效價，但是該方法受多種外源因素影響如血細胞種類、新鮮度等。該方法敏感性及特異性均低于分子檢測方法，因此常作為檢測的輔助手段及病毒分型鑒定方法。

2.2 ELISA ELISA法因其操作簡單、靈敏便捷被認為是當前疾病檢測的主要方法之一。ELISA不僅可以進行抗原檢測，還可應用于免疫抗體的檢測及評價，是多樣品檢測的最好試驗方法之一，廣泛應用于流行病學調查。Elia利用昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)的CPV VP2蛋白作為間接ELISA的包被抗原，構建CPV的間接ELISA方法，使用該方法可用來檢測母源抗體對幼崽的干擾閾值[19]。趙國星首次利用桿狀病毒/昆蟲細胞表達的CPV病毒樣顆粒作為包被抗原，建立了一種檢測CPV抗體的間接ELISA方法，該方法特異性強，重復性好，標準陽性血清1∶640稀釋仍能檢出陽性，可適用于大量樣本檢測并作為流行病學調查的可靠方法[20]。近年來，相繼建立了CPV競爭ELISA法、雙抗體夾心ELISA法、Dot-ELISA法等，這些方法都已被應用到血清學抗體檢測及制成商品化試劑盒[21]。ELISA檢測方法因其穩(wěn)定、簡便、可批量樣品檢測等優(yōu)勢，已成為免疫學檢測技術中應用最廣泛的方法之一。

2.3 免疫層析技術 免疫層析技術被廣泛應用到快速檢測卡制備，已建立多種病毒的檢測卡如犬瘟熱病毒、豬流行性腹瀉病毒和犬細小病毒等。該方法應用膠體金標記技術使抗原抗體特異性結合更直觀，更準確。當前研究制備的檢測試紙條是獸醫(yī)臨床一線和寵物醫(yī)院必備的疾病診斷工具，可快速的讀取結果，是作為診斷治療的重要輔助手段。朱軍等測試了3種商品化CPV快速檢測卡的臨床使用效果并與PCR診斷相比對，共計檢測了213份糞便樣品，3種檢測卡的敏感性在66.4%～72.2%，特異性在96%以上，符合率為95.8%～99.5%之間，表明當前商品化快速檢測卡基本無差異，檢測結果真實可靠，雖然相比PCR方法敏感性低，但是其快速、經濟、簡單，獲得使用者的一致認可，也為診斷治療爭取了寶貴的時間[22]。Tinky等研究者利用IC試紙條與PCR方法同時進行糞便樣品檢測，結果顯示IC試紙條相對PCR敏感性為72.22%，特異性為92.86%，使用McNemar統(tǒng)計分析顯示兩種方法差異不顯著(P>0.5)，因此IC試紙條可作為臨床快速診斷的有效工具[23]。但是當前使用的商品化試紙條價格普遍偏高，不適于大量樣本的快速診斷，因此馬輝等學者為了降低免疫層析試紙條的使用成本，制備了可穩(wěn)定產生CPV單克隆抗體的雜交瘤細胞株3E2，建立了一種免疫膠體金層析試紙條，該方法特異性強，重復性好，具備較高的市場應用價值[24]。隨著免疫膠體金技術的快速發(fā)展，有研究建立了雙抗體夾心法CPV膠體金試紙條(CPV-GIA)，利用該方法評價CPV疫苗免疫效果，依據(jù)可使免疫試紙條消失的最高血清稀釋倍數(shù)判斷CPV的抗體HI效價，數(shù)據(jù)顯示血清最高稀釋倍數(shù)乘以4即為HI效價，該方法與HI檢測效價符合率為90.7%，CPV-GIA可作為犬CPV抗體水平評價快捷且簡單的方法[25]。目前，免疫膠體金試紙條技術成熟穩(wěn)定可直接采集肛門拭子進行測試，并在10 min內即可讀取結果，已成為寵物醫(yī)院CPV檢測的主要方法。

3 其他檢測方法

隨著試驗和臨床檢測的要求越來越高，CPV檢測技術也在不斷更新進步，當前為了滿足多類型CPV毒株的檢測，如快速微型測序方法可實現(xiàn)毒株快速分型，可廣泛應用于精準診斷和流行病學調查[26]；PCR-RFLP應用于CPV和MEV的檢測及鑒別[27]。同時為了評價疫苗免疫后CPV抗體水平，有學者建立了CPV IgM-IgG雙重快速測定法[28]；Thomas同時也利用截短的VP2蛋白構建了乳膠凝集試驗(LAT)評價血清中CPV中和抗體[29]。根據(jù)當前不同的試驗需求，研究者不斷的將新型檢測技術應用到CPV檢測中，并開發(fā)出具有多種功能的新型檢測方法。

4 結 語

CPV基因突變率與RNA病毒相當，形成CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c等變異毒株，促使實驗室和獸醫(yī)臨床檢測技術需要不斷創(chuàng)新以滿足科研與生產的需要。分子生物學檢測技術是實驗室范圍內最敏感，最準確的檢測手段，但是因其需要昂貴的實驗設備、費時及專業(yè)的操作人員，并不能大規(guī)模推廣應用。免疫學技術可檢測到血清中抗體，但是不能檢測急性感染，因此免疫學檢測方法常被用來做疫苗免疫后的抗體水平分析及為犬制定免疫計劃。因此依據(jù)當前CPV檢測需求，選擇合理的診斷方法才能獲得真實有效的檢測結果。目前，實驗室檢測多使用高敏感性和特異性的多重qPCR實現(xiàn)CPV毒株類型精準鑒定。寵物醫(yī)院等臨床工作者更偏向使用免疫膠體金試紙條作為CPV快速診斷工具，并結合血常規(guī)等結果判定急性感染病例。但是有學者對CPV臨床和實驗室診斷技術可靠性進行評價分析，顯示PCR和免疫試紙條對陽性病例的診斷并沒有足夠的敏感性[30]。希望隨著科學技術的發(fā)展，建立一種快速、敏感、低成本的檢測技術，滿足CPV實驗室和臨床檢測需求，為當前細小病毒臨床檢測、基因變異、宿主范圍擴展機制提供有效的試驗方法。