劉業(yè)兵，曹利利，郭衍冰，才學(xué)鵬*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，長春 130062 )

弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，可感染所有溫血動物[1-2]。感染宿主后隨著血液到達(dá)全身各個部位，對人及動物造成極大的威脅。人感染率一般為10%～60%[3]，最高可達(dá)95%[4]，我國人群弓形蟲平均感染率約為10%[5]，孕婦感染弓形蟲后約有20%的機率從母體垂直傳播給胎兒[6]，引起胎兒先天性感染，造成流產(chǎn)或死胎等。弓形蟲感染免疫功能減退或受損的機體可能會造成廣泛的病理損害甚至危及生命。

弓形蟲可感染豬、牛、羊等家畜，在一些伴侶動物犬、貓、兔等弓形蟲感染情況較為普遍，在給畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失的同時，也為食品安全與人類健康埋下了重大隱患[7]。弓形蟲感染動物后常表現(xiàn)為非特異的臨床癥狀，無法根據(jù)臨床癥狀實現(xiàn)準(zhǔn)確診斷。因此，了解動物弓形蟲檢測技術(shù)的研究進展及應(yīng)用情況，對切實維護養(yǎng)殖業(yè)安全、動物源性食品安全、公共衛(wèi)生安全至關(guān)重要。

1 病原學(xué)檢測

病原學(xué)檢查常用的方法包括鏡檢法和接種法。前者主要是根據(jù)樣本(肺、肝、淋巴結(jié)或體液、腦脊液等)特性，選擇涂片、固定或染色等方式通過顯微鏡觀察結(jié)果[8]；后者是將樣本經(jīng)處理后通過接種至動物、雞胚或細(xì)胞(如Hela、Vero)等進行培養(yǎng)，而后檢測弓形蟲的方法[9]，這兩種方法雖然不適合大批量樣本的快速檢測，但操作較為簡單，結(jié)果直觀可靠，在動物弓形蟲的診斷及預(yù)防中發(fā)揮了重要作用。Khademvatan S等以顯微鏡直接涂片檢查了伊朗230只嚙齒動物的弓形蟲寄生情況，結(jié)果顯示有1例感染[10]。Atasever A等使用血清為弓形蟲陽性的鵪鶉組織接種小鼠，并順利從感染小鼠的腹膜液中分離并鑒定出弓形蟲[11]。在弓形蟲病的檢測實踐過程中，傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法因費時、費力以及檢出率低等原因，已無法滿足高效、快速檢測人和動物弓形蟲感染的需求。

2 血清學(xué)檢測

血清學(xué)方法是上個世紀(jì)實驗室檢測弓形蟲的首選和最常用的方法。該方法主要使用弓形蟲特異性抗原，通過測定宿主感染后體內(nèi)相應(yīng)抗體(IgA、IgM、IgG和IgE)進行判定。大多數(shù)血清學(xué)方法使用弓形蟲裂解物抗原(TLA)、小鼠或組織培養(yǎng)物中的速殖子抗原作為天然抗原。但是，制備這些抗原所需的實驗室條件及技術(shù)要求各不相同，且制備費時、成本較高以及存在感染風(fēng)險等問題不容忽視[12]。

2.1 薩賓-費爾德曼染色試驗(Sabin-Feldman dye test, SFDT) Sabin和Fedman 1948年首次提出SFDT，利用活的弓形蟲滋養(yǎng)體能被堿性美藍(lán)染成藍(lán)色的特性，以加入致活劑和免疫血清(抗體)后不著色或著色很淡為判斷陽性的依據(jù)，可用于早期檢測，被認(rèn)為是弓形蟲感染血清學(xué)檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，很多學(xué)者運用SFDT法對不同動物進行過弓形蟲檢測。Chadwick EA 等通過該方法檢測英國水獺中弓形蟲的感染率為39.5%，表明淡水生態(tài)系統(tǒng)因糞便含有卵囊而導(dǎo)致較高的流行率[13]。Beyhan YE等以SFDT檢測發(fā)現(xiàn)，弓形蟲在研究區(qū)域的水牛中相當(dāng)常見，感染率高達(dá)87.79%[14]。SFDT與其他方法相比具有較高的符合率，作為一種最早被使用和公認(rèn)的敏感度高、特異性強、重復(fù)性好的血清免疫學(xué)方法，因其需要以活蟲為抗原和含有輔助因子的血清作為致活劑，不僅增加了試驗的危險性，還加大了檢測成本及操作難度，極大限制了該方法的推廣應(yīng)用。

2.2 凝集試驗

2.2.1 改良凝集試驗(Modified agglutination test , MAT) MAT是Dubey和Desmonts于1987年在直接凝集試驗(Direct haemagglutination test，DAT)基礎(chǔ)上建立的一種特異、敏感的弓形蟲檢測方法。檢測前只需制備純凈的弓形蟲速殖子，其表面抗原能夠與被檢血清中弓形蟲特異性IgG抗體發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)染色后可依據(jù)反應(yīng)孔底部的抗原積層進行判斷。MAT的特異性和敏感性與DAT相似，有報道稱MAT在對犬血清檢測過程中會出現(xiàn)較高的假陰性[15]，但該方法對其他寄生蟲無特異性反應(yīng)，且操作程序及所需試驗工具相對簡單，判定標(biāo)準(zhǔn)明確，對于樣本的初篩具有重要的意義。Feg V等以MAT法檢測散養(yǎng)雞群弓形蟲感染情況，結(jié)果顯示感染率為16.6%[16]。Almería S等利用MAT法調(diào)查發(fā)現(xiàn)，綿羊的弓形蟲感染率為41.2%，牛為18.6%，山羊為5.6%；在野生蹄類動物中，紅鹿的弓形蟲感染率為10.5%，黇鹿為15.6%，摩弗倫羊為5.6%，西班牙山羊為5.6%，獐鹿為13.6%，野豬為18.6%[17]。Heddergott M等用MAT在歐洲中部檢測浣熊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約有37.4%的感染弓形蟲[18]。至今，MAT方法因其良好的特異性及敏感性一直被各國廣泛應(yīng)用于動物弓形蟲的調(diào)查或研究工作中。

2.2.2 間接血凝試驗(Indirect hemagglutination test, IHA) IHA是利用弓形蟲可溶性抗原致敏于紅細(xì)胞表面，當(dāng)與相應(yīng)抗體相互反應(yīng)時即可出現(xiàn)肉眼可見的凝集。因IHA方法具有操作簡便、敏感性高、特異性強等特點，故而適于大規(guī)模的流行性調(diào)查。Zhang XX等對我國北方流浪狗檢測發(fā)現(xiàn)弓形蟲感染率為14.05%[19]。Luo H等對我國江西省動物園及家畜弓形蟲感染調(diào)查結(jié)果顯示，長頸鹿感染率為27%，狼為20%，河馬為17%，小天鵝為22%；家畜中山羊感染率為10%，水牛為17%，牛為11%[20]。同時，對湖北野生動物的調(diào)查結(jié)果顯示，野豬感染率為7.2%，野兔為5.1%，野雞為12.6%[21]。Wu F等利用IHA 法在屠宰豬中檢測弓形蟲感染率為19.9%[22]。但是，致敏紅細(xì)胞的不穩(wěn)定性使該方法易產(chǎn)生非特異性凝集，與其他診斷方法相比重復(fù)性較差[23]。

2.2.3 乳膠凝集試驗(Latex agglutination test, LAT) LAT是以乳膠顆粒包被弓形蟲可溶性抗原，加入待檢血清后，通過觀察凝集反應(yīng)進行結(jié)果判定，若結(jié)果為陽性則需要再以其他血清學(xué)方法開展進一步檢查。Patel KK等以市售LAT和ELISA試劑檢測新西蘭的養(yǎng)殖紅鹿，以此評估兩者敏感性和特異性分別為84.4%和91.1%[24]。Oi M等利用商品化LAT調(diào)查了日本東京1999-2001年和2009-2011年間被收容的貓、狗的弓形蟲感染血清陽性率，結(jié)果顯示十年中感染率幾乎無變化(貓由5.6%變?yōu)?.7%，狗由1.8%變?yōu)?.9%)[25]?？梢哉f，LAT具有操作簡便、結(jié)果易判及特異性良好等特點，能夠快速方便的檢測到抗弓形蟲IgG抗體，適合于動物弓形蟲的早期感染和抗體檢測，常作為現(xiàn)場檢測和大范圍流行病學(xué)篩查的手段。

2.3 間接熒光抗體試驗(Indirect fluorescence antibody test, IFAT) 間接熒光抗體試驗以固定的弓形蟲速殖子制作抗原片，通過熒光素標(biāo)記的二抗檢測特異性抗體，具有較高的敏感性、特異性和重現(xiàn)性等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于動物弓形蟲血清IgG或IgM抗體的檢測，是目前檢測早期感染較為理想的血清學(xué)試驗方法之一[26]。Gos ML等通過該方法以弓形蟲(RH株)和犬新孢子蟲(NC1株)速殖子作為抗原，使用兔抗山羊IgG-FITC的二抗來檢測阿根廷兩個省山羊的弓形蟲和犬新孢子蟲的感染情況，結(jié)果顯示流行率分別為40.8%和5.5%[27]。Machacova T等使用IFAT發(fā)現(xiàn)意大利北部的兔子弓形蟲和犬新孢子蟲感染率分別為14.6%和1.2%[28]。Bártová E等對尼日利亞三個州的120匹馬和24頭驢進行弓形蟲和新孢子蟲檢測發(fā)現(xiàn)，馬的感染率分別為24%和8%；驢中僅檢測到弓形蟲，血清陽性率為17%[29]。目前，該技術(shù)在國外廣泛被應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查，且已有敏感、穩(wěn)定的市售試劑盒，相比之下，國內(nèi)關(guān)于IFAT檢測動物感染弓形蟲的報道較少，可能因其需要專業(yè)熒光顯微鏡觀察而限制了該方法的推廣使用。

2.4 免疫層析技術(shù)(Gold immunochromatographic assay ,GICA) GICA主要由標(biāo)記技術(shù)和層析技術(shù)組成，利用抗原與抗體反應(yīng)原理，以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，通過固相膜為載體而設(shè)計的檢測方法。作為一種簡單、便捷的血清學(xué)檢測方法，適于養(yǎng)殖場及野外現(xiàn)場動物弓形蟲的檢測。王艷等將利用弓形蟲重組抗原SAG1組裝成膠體金免疫層析試紙條篩選犬弓形蟲病，與ELISA試劑盒進行對比符合率較高[30]。孫雪霏利用弓形蟲重組蛋白GRA7制備膠體金試檢測紙條，檢測176份豬血清的結(jié)果與Gold-ELISA方法比較具有較高的一致性[31]。目前，免疫層析技術(shù)因具有快速、操作簡便、結(jié)果易判和不需特定儀器等優(yōu)點，得到了廣泛的應(yīng)用。但是當(dāng)前市場中試紙條的產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，存在特異性不高、假陽/陰性等現(xiàn)象。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked Immunosorbent Assay ,ELISA) ELISA方法利用酶的高效催化作用及底物放大反應(yīng)效果，使檢測靈敏度大大提高，提高了特異性抗原和抗體在免疫反應(yīng)過程中的敏感性，既可用于檢測抗原也可以檢測抗體。目前，國內(nèi)外已研制出很多反應(yīng)靈敏、特異性高、重復(fù)性好的動物弓形蟲ELISA檢測試劑盒，主要檢測循環(huán)抗原(CAg)和特異性抗體(IgM和IgG)，適于大批量血清樣品的檢測，是血清學(xué)方法中一種方便且安全的方法。常用的包括間接ELISA、斑點ELISA(Dot-ELISA)、親和素-生物素復(fù)合ELISA(ABC-ELISA)及雙抗夾心ELISA(DS-ELISA)等。如Zhuo X等以弓形蟲rMAG1為包被抗原建立的間接ELISA檢測方法，對93份狗血清進行檢測，結(jié)果顯示其特異性和敏感性均高于以TLA為包被抗原建立的間接ELISA方法[32]。宮楓舉等建立了檢測弓形蟲循環(huán)抗原的夾心ABC-ELISA方法，檢測68份豬臨床血樣與Nest-PCR結(jié)果一致，表明該方法特異性強、敏感性高，可用于弓形蟲急性感染的早期或活動期的診斷[33]?？芙鹑A用制備的抗弓形蟲重組蛋白SAG3單克隆抗體建立豬弓形蟲雙抗夾心ELISA法，并對廣東、吉林地區(qū)各94份豬血清樣品進行檢測，陽性率分別為20.2%和11.7%，與建立的膠體金試紙條做對比，兩者符合率分別為90.90%和89.47%[34]。ELISA及其衍生的一系列血清學(xué)方法具有可重復(fù)、易自動化和標(biāo)準(zhǔn)化等特點，還能用于定性和定量檢測，是目前應(yīng)用最廣的動物弓形蟲檢測方法。

3 分子生物學(xué)檢測

3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR) PCR技術(shù)可在較短時間內(nèi)擴增弓形蟲基因組的特定片段，產(chǎn)生數(shù)百萬個拷貝的靶DNA分子，與其他衍生出的檢測方法，如巢氏PCR、多重PCR和PCR-RFLP等方法一樣，都能通過多次擴增基因片段而提升檢測的敏感性和特異性。常用的引物靶基因有B1基因、529 bp重復(fù)序列、18S rDNA、核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和SAG1 (P30)基因等，這些基因在所有弓形蟲株中均為高度保守。Liu XC等基于弓形蟲ITS-1基因構(gòu)建PCR法，對雞場進行檢測，結(jié)果顯示2%的散養(yǎng)雞場為弓形蟲陽性，而規(guī)模養(yǎng)殖場未發(fā)現(xiàn)弓形蟲[35]。Nabi H等的研究表明，與顯微鏡法相比，PCR是檢測貓弓形蟲糞便卵囊的更可靠方法[36]。Cong W等以半巢式PCR檢測弓形蟲B1基因和PCR-RFLP方法對我國山東省618份驢肌肉樣本進行檢測，并首次從驢體內(nèi)分離出弓形蟲ToxoDB#1基因型[37]。Lukasova R等對2014-2015年期間來自南非110份野生鳥和15份家養(yǎng)鳥的腦組織樣本進行調(diào)查，通過PCR方法確定2.7%的野生鳥存在弓形蟲感染，且采用多重PCR對陽性樣品進行基因分型分析，結(jié)果確定紅眼鴿感染的弓形蟲為II型[38]。隨著技術(shù)體系的不斷完善和發(fā)展，PCR及相關(guān)衍生技術(shù)因快速、靈敏、簡便和可靠等特點被廣泛應(yīng)用。

3.2 實時定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR) qPCR是將探針技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合，每個循環(huán)中通過探針和嵌合染料檢測到擴增產(chǎn)物，利用標(biāo)準(zhǔn)已知濃度進行定量，又稱熒光定量PCR。該方法具有較高的特異性和敏感性，可用于評估動物弓形蟲的感染強度及治療效果。Sroka J等檢測60份羊奶樣品，陽性率為65%，而巢式PCR僅為43%[39]。Camilo LM等利用B1和REP-529引物對807個巴西患者臨床樣品進行RT-PCR測定，結(jié)果顯示REP-529引物組優(yōu)于B1組[40]。由于qPCR是一個單管封閉系統(tǒng)，相比常規(guī)PCR和巢式PCR等具有靈敏度高和假陽性較少等優(yōu)勢已被廣泛應(yīng)用。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) LAMP是在Bst DNA聚合酶參與下用4對引物識別弓形蟲靶基因的6個區(qū)域，在等溫條件下使靶基因高效擴增，產(chǎn)物可通過熒光定量、電泳檢測，也可通過濁度計或者離心后肉眼觀察沉淀的方法。Lass A等通過RT-PCR和靶向B1基因的LAMP方法分析弓形蟲病的起源可能追溯到空氣[41]。Lalle M等以529 bp重復(fù)序列為靶向的LAMP檢測到每50 g即食生菜中弓形蟲卵囊為25個[42]。由于LAMP檢測時僅需水浴或普通加熱裝置，能直接觀察到擴增產(chǎn)物，在沒有精密儀器條件下是一種快捷、簡便、敏感的診斷方法，其靈敏度和擴增效率遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR。

4 問題與展望

弓形蟲是一種機會性致病原蟲，迄今尚無理想的治療藥物，因而精準(zhǔn)的檢測對于動物弓形蟲的有效防控至關(guān)重要。病原學(xué)檢測方法直觀且準(zhǔn)確性較高，但大規(guī)模檢測存在工作量和誤差較大，費時費力，無法滿足檢測需求。靈敏度高、特異性強的分子生物學(xué)方法為我們提供了一種較為準(zhǔn)確且標(biāo)準(zhǔn)化的檢測手段，但檢測過程繁瑣，需特殊儀器設(shè)備及人員素質(zhì)要求高，大大降低了在基層的推廣使用。血清學(xué)檢測方法尤其是ELISA方法是目前臨床應(yīng)用最廣泛的檢測方法，然而，縱觀國內(nèi)外動物弓形蟲血清學(xué)檢測方法的研究及應(yīng)用現(xiàn)狀，大多數(shù)試劑盒都使用TLA，目的是欲獲得較高敏感性和特異性的檢測結(jié)果，這些方法卻存在普遍的局限性，如無法估計弓形蟲感染的準(zhǔn)確階段，試驗難以進行標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范和受其他寄生蟲干擾等。因此，動物弓形蟲檢測仍存在諸多問題亟待解決。

然而，相較于以往，動物弓形蟲的檢測技術(shù)已有較大進展，國內(nèi)外弓形蟲檢測相關(guān)產(chǎn)品的研究也越來越多，很多研究成果已經(jīng)或正在從實驗室向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。如今，基因工程技術(shù)發(fā)展日趨成熟，弓形蟲抗原相關(guān)研究有了很多新進展，隨著弓形蟲重組抗原、嵌合抗原和多表位肽抗原研究不斷深入，人們逐步以重組抗原代替TLA進行動物弓形蟲的血清學(xué)檢測，打破傳統(tǒng)檢測方法的局限性已不再是空談。相信隨著科技的不斷進步，動物弓形蟲檢測方法將會朝著簡便、快速、精準(zhǔn)、經(jīng)濟以及滿足多種檢測需求的發(fā)展方向繼續(xù)前行。