王 歡，朱向情，李慧萍，尹 娜，甘世保，楊 靜，李麗娟，潘興華，魏 玲

心肌細胞凋亡是心肌重構(gòu)的主要病理基礎(chǔ)，它在心衰、心律失常等多種心臟疾病的病理生理中起著重要作用。本課題組前期研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）在心肌微環(huán)境下，能向心肌細胞、浦肯野細胞及內(nèi)皮細胞分化，并分泌各種細胞因子，抑制心肌細胞凋亡，促進心肌細胞生長，減少基質(zhì)膠原沉積，減輕心肌纖維化[1]。Klotho基因是1997年Kuro等研究自發(fā)性高血壓大鼠時偶然發(fā)現(xiàn)的新型抗衰老基因，具有抗氧化應激、減少炎癥反應、抑制心肌細胞及血管內(nèi)皮細胞凋亡、改善心肌微環(huán)境等作用[2]。本研究將重組慢病毒介導的Klotho基因轉(zhuǎn)染至BMSC，并移植到慢性心衰大鼠心肌中，探討Klotho基因修飾的BMSC移植對慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠24只，其中 18 只鼠齡約 3 月齡，體重（300±30）g，用于心衰大鼠模型制備，另外6只為正常組；另有6只1月齡大鼠，體重（100±20）g，用于制備 BMSC。所用動物均由昆明醫(yī)科大學動物實驗中心提供[動物許可證號：SCXK（滇）2011-0005]。置動物房適應性喂養(yǎng)1 w，自由攝食及飲水，實驗前12 h禁食。

1.2 試劑與儀器 DMEM-F12細胞培養(yǎng)基（北京HyClone 公司），胎牛血清（FBS，美國 BI公司），胰蛋白酶-EDTA消化液、青-鏈霉素抗生素（北京Solarbio公司），SD大鼠BMSC成骨、成脂誘導分化培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物科技有限公司）；鹽酸異丙腎上腺素注射液（上海禾豐制藥有限公司），Masson染色試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司），慢病毒載體LVEGFP-Klotho基因，LV-EGFP基因（上海吉凱生物有限公司）。

1.3 BMSC的分離培養(yǎng)及Klotho基因轉(zhuǎn)染 取1月齡大鼠，按本課題組另文報道的方法制備、鑒定BMSC。取第 3代 BMSC，以 5×105個細胞/孔鋪板于48孔板，至細胞覆蓋率達70%時，按預先測的最佳感染復數(shù)（MOI值）150計算并加入慢病毒LV-EGFP、LVKlotho病毒液，進行慢病毒LV-EGFP-Klotho基因轉(zhuǎn)染BMSC。取病毒轉(zhuǎn)染1 w后的BMSC，同時以未轉(zhuǎn)染BMSC及EGFP-BMSC為對照。用Trizol法提取總RNA，測定RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并以cDNA為模板，擴增目的基因片段。PCR引物由上海生工生物有限公司合成。大鼠Klotho引物：上游CAATGG CTTCCCTCCTTTACCT，下游 TTCTCTTCTTGGCTAC AACCCC，內(nèi)參GAPDH引物：上游5'TTCCTACCCC CAATGTATCCG3'，下游 5'CATGAGGTCCACCACCC TGTT3'。PCR反應條件為預變性95℃、10 min，再一步變性95℃、15 s，退火延伸60℃、60 s，共40個循環(huán)。PCR結(jié)束后，根據(jù)每個樣本反應后達到熒光信號閾值的循環(huán)數(shù)（Ct值）計算 2-△△Ct值。

1.4 大鼠心衰模型制備及分組 實驗大鼠腹腔給予異丙腎上腺素注射，3 mg/(kg·d)，共 14 d，建立慢性心衰大鼠模型。隨機將18只慢性心衰模型大鼠分為Klotho-BMSC、BMSC、模型組，同時設(shè)正常組，每組6只。Klotho-BMSC組和BMSC組分別經(jīng)尾靜脈注射攜帶Klotho基因的EGFP基因標記BMSC(EGFP-Klotho-BMSC)和僅EGFP基因標記的BMSC(EGFP-BMSC)5×106個/ml，1 ml/只；模型組經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水，正常組不做處理，

1.5 大鼠心肌細胞凋亡檢測 BMSC治療后28 d，取各組大鼠心肌組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、連續(xù)切片，切片厚度為 5 μm，進行 TUNEL染色。另取各組大鼠心肌組織標本進行OCT包埋及冰凍切片（15 μm），在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染EGFP的BMSC存活及分布情況。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多個樣本均數(shù)間的比較采用方差分析和LSD-t檢驗；兩變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSC形態(tài)觀察 BMSC分離培養(yǎng)48 h后，可見短小梭形、三角形的BMSC貼壁生長；4 d后集落形成，細胞體積增大，多呈長梭形；原代細胞10 d左右達90%以上融合，為均一呈漩渦狀排列的長梭形細胞群。傳代后細胞增殖時間縮短，形態(tài)為成纖維樣，平均4 d達85%以上融合。見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染Klotho后各組Klotho mRNA表達量比較RT-PCR檢測結(jié)果顯示，模型組、BMSC組、Klotho-BMSC組的Klotho mRNA相對表達量分別為0.4256±0.4464、0.4185±0.4251 和 1.000±0.7076，Klotho-BMS 組顯著高于其他兩組（P＜0.05）。

2.3 Klotho-BMSC治療4 w后各組心肌組織綠色熒光分布 熒光顯微鏡下可見，Klotho-BMSC組和BMSC組有EGFP標記的BMSC在心肌組織中分布，并且Klotho-BMSC組明顯多于單純BMSC組，而模型組和正常組未見EGFP陽性細胞分布（圖2）。

2.4 各組心肌Klotho mRNA表達水平比較 各組大鼠心肌組織中均有Klotho基因表達（圖3）。正常組、模型組、BMSC組、Klotho-BMSC組心肌組織中Klotho基因的mRNA相對表達量分別為1.803±0.530、0.782±0.145、1.207±0.214、4.857±0.597。 Klotho-BMSC組的Klotho mRNA表達水平較模型組、BMSC組高（P＜0.01），BMSC組與模型組之間無顯著差異（P ＞ 0.05）。

2.5 Klotho-BMSC治療4 w后各組心肌細胞凋亡率比較 正常組心肌細胞凋亡數(shù)量很少；腹腔注射ISO后，心肌細胞凋亡率增加，BMSC組為（23.55±3.62）%、Klotho-BMSC 組為（12.61±2.00）%、模型組為（43.61±4.88）%,較正常組（1.53±0.69）%顯著升高（P＜ 0.01）。 而 Klotho-BMSC 組、BMSC 組低于模型（P＜0.01），以Klotho-BMSC組降低最明顯（P＜ 0.01）。

2.6 心肌細胞凋亡率與心肌組織Klotho mRNA的相關(guān)性分析 各組心肌組織Klotho mRNA的表達量及心肌細胞凋亡率均呈正態(tài)分布。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，心肌Klotho mRNA表達量與心肌細胞凋亡率呈顯著負相關(guān)（r=-0.598，P＜0.05）。

3 討論

圖1 BMSC培養(yǎng)形態(tài)觀察

心肌細胞凋亡是心肌重構(gòu)期心肌收縮單元不斷喪失的主要原因[6]。研究顯示，心肌細胞凋亡后，其自我修復能力是極其有限的，不足以彌補心肌細胞數(shù)的減少及維持心肌損傷的修復，其對早期及晚期心肌重構(gòu)乃至心衰的產(chǎn)生和惡化均有促發(fā)作用[7]。BMSC具有自我更新及高度增殖能力，能自體移植，能向多種組織分化，并且具有修復受損組織的潛能[3]。王永等[3]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC移植能改善犬急性心肌梗死后心肌纖維化，其心肌間質(zhì)膠原含量隨著時間呈減少趨勢。徐燕等[4]研究證明，BMSC能治療擴張型心肌病大鼠，細胞移植4 w后，大鼠心功能明顯改善，心肌膠原含量減少，心肌MMP-2及MMP-9的表達降低，心肌纖維化明顯改善。本研究與上述實驗結(jié)果類似，也發(fā)現(xiàn)BMSC移植治療慢性心衰大鼠4 w后，大鼠心肌細胞變性壞死程度較模型組明顯減少，提示BMSC具有抗慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡的作用。

圖2 EGFP標記的大鼠BMSC在心衰大鼠心肌內(nèi)的分布情況

圖3 心肌組織中Klotho mRNA表達水平的實時定量PCR檢測結(jié)果

Klotho基因具有抑制血管緊張素Ⅱ誘導活性氧族產(chǎn)生、抑制細胞衰老及凋亡、抗炎癥反應、維持內(nèi)皮細胞完整性、促進NO的產(chǎn)生、改善動脈順應性、改善心肌重構(gòu)及纖維化等作用[5-6]。本實驗將Klotho基因轉(zhuǎn)染至EGFP基因標記的BMSC，并成功移植到慢性心衰大鼠心肌中，熒光顯微鏡下可見，Klotho基因修飾后的BMSC在心肌組織中的存活率明顯增加，而心肌細胞凋亡率進一步降低。本研究結(jié)果提示，BMSC本身具有抑制心衰大鼠心肌細胞凋亡、纖維化的功能，Klotho基因修飾BMSC移植治療慢性心衰大鼠,可顯著提高BMSC在心肌組織中的存活率，使其抑制心肌細胞凋亡的作用更加顯著。

[1] Takuy a Narita,Ken Suzuki,etal.Bonemarrow derived mesenchymal stem cells for the treatment of heart failure[J].Heart Fail Rev,2015,20(1):53-68.

[2] Ikushima M,Rakugih I,Shikawa K,et al.Anti-apoptotic and anti-senescence effects of klotho on vascular endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,339(3):827-832.

[3] 王永，范家偉，方五旺.犬自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植對心肌梗死后膠原纖維含量影響的實驗研究[J].醫(yī)學綜述，2010，16（23）：3656-3659.

[4] 徐燕，張瑤，李麗麗.骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療大鼠擴張型心肌病[J].中國組織工程研究，2012,16（14）:2576-2580.

[5] Semba RD,Cappola AR,Sun K,et al.Plasma Klotho and cardiovascular disease in adults [J].Am Geriatr Soc,2011,59（9）：1596-1601.

[6] Six I,Okazaki H,Gross P,et al.Direct acute effects of Klotho and FGF23 on vascular smooth muscle and endothelium[J].PLoS One.2014,9(4):e93423-e93423.