趙燕穎，王秀巖，秦國濤，孫遠(yuǎn)杰，劉志忠，李然偉

(1.吉林大學(xué)第四醫(yī)院消化內(nèi)科，吉林 長春130011；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，吉林 長春130041)

腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的一個重要因素。腫瘤血管形成是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要因素。腫瘤血管形成受多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 是最重要的調(diào)節(jié)因子之一[1-2]，其中VEGF165是體內(nèi)含量最多和最為重要的的亞型，而新發(fā)現(xiàn)的VEGF變構(gòu)體VEGF165b具有抑制VEGF165的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的作用[3]。目前國內(nèi)外尚無關(guān)于VEGF165b對于肝癌HepG2細(xì)胞生物學(xué)特性影響的報(bào)道。本研究擬觀察人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)VEGF165b的質(zhì)粒后VEGF165b和VEGF165 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，以及肝癌細(xì)胞生存率和遷移能力的變化，進(jìn)一步探索VEGF165b對肝癌生物學(xué)特性的影響，為臨床肝癌的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑可表達(dá)VEGF165b的合成質(zhì)粒PcDNA-VEGF165b由吉林大學(xué)第二醫(yī)院李然偉教授惠贈。胎牛血清和IMDM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，RT-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，VEGF165b和VEGF165一抗購自英國Abcam公司，二抗、Western blotting Luminol Reagent和PVDF 膜購自美國Santa Cruz 公司。引物由上海生工生物工程公司合成。Matrigel和Transwell小室購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染HepG2人肝癌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。細(xì)胞在IMDM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清,青霉素100 mg·L-1,鏈霉素100 mg·L-1)中,5%CO2孵箱內(nèi)37℃培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后接種于孔板或培養(yǎng)瓶后再用無抗生素IMDM培養(yǎng),細(xì)胞融合率達(dá)80%～95%時可以轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分為空白組(只加轉(zhuǎn)染試劑)、對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照PcDNA3.0表達(dá)載體)和PcDNA-VEGF165b組(轉(zhuǎn)染PcDNA-VEGF165b表達(dá)載體)。操作按LipofectamineTM2000試劑說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后6～24 h換液1次,繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測HepG2細(xì)胞的增殖按照5×103個細(xì)胞/孔將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板,培養(yǎng)至細(xì)胞80%融合后分為空白組、對照組和PcDNA-VEGF165b組,分別轉(zhuǎn)染LipofectamineTM2000、PcDNA3.0和PcDNA-VEGF165b(終濃度均為50 nmol·L-1)。分別于轉(zhuǎn)染后24、48和72 h,每孔加入15 μL MTT(5 g·L-1)繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,再加入DMSO(150 μL/孔),振蕩10 min后采用酶標(biāo)儀(570 nm)測定吸光度(A)值。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞生存率:細(xì)胞生存率=(實(shí)驗(yàn)組A值/空白組A值)×100%。每組設(shè)3個平行孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blotting法檢測VEGF165b和VEGF165蛋白表達(dá)水平收集轉(zhuǎn)染48 h后各組HepG2細(xì)胞(分組同上),用PBS洗1次，按1×107個細(xì)胞加入100 μL預(yù)冷至4℃的裂解液,超聲粉碎細(xì)胞，低溫離心后取上清液-80℃凍存。為確保蛋白上樣量一致,樣品中蛋白經(jīng)Bradford定量,然后加入2×SDS凝膠加樣緩沖液100℃煮沸變性,樣品中蛋白通過12%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上,脫脂奶粉封閉4℃過夜；分別加入兔抗人VEGF165b、VEGF165和β-actin抗體(1∶500),4℃過夜；用TBST洗膜10 min,3次,加入1∶2 000稀釋的羊抗兔二抗,振搖1 h,TBST洗膜,DAB顯色,拍照。分析系統(tǒng)測定各條帶灰度值，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106L-1,Transwell小室內(nèi)加入200 μL細(xì)胞懸液,分組同上。常規(guī)培養(yǎng)24 h后用0.1%結(jié)晶紫細(xì)胞染色，染色后可用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標(biāo)儀上570 nm處測其A值，間接反映細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

2 結(jié) 果

2.1 各組HepG2細(xì)胞生存率空白組、對照組和PcDNA-VEGF165b組HepG2細(xì)胞生存率,24 h時分別為100.0%、(98.1±4.8)%和(96.9±3.7)%，48 h時分別為100.0%、(97.5±5.1)%和(93.1±4.3)%，72 h時分別為100.0%、(96.1±5.0)%和(91.8±4.9)%，各個時間點(diǎn)組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組HepG2細(xì)胞中VEGF165b和VEGF165 mRNA表達(dá)水平與空白組(0.319±0.049和0.881±0.052)比較，對照組HepG2細(xì)胞中VEGF 165b和VEGF165 mRNA表達(dá)水平(0.401±0.055和0.798±0.049)無明顯變化(P>0.05)。與空白組比較，PcDNA-VEGF165b組VEGF165b mRNA表達(dá)水平(0.998±0.081)明顯升高(P<0.01)，VEGF165 mRNA表達(dá)水平(0.278±0.024)明顯降低 (P<0.01)。見圖1。

Lane 1:DNA marker；Lane 2： PcDNA-VEGF165b group；Lane 3：Control group；Lane 4：Blank group.

2.3 各組細(xì)胞中VEGF165b和VEGF165 蛋白表達(dá)水平與空白組(0.266±0.029和0.791±0.043)比較，對照組HepG2細(xì)胞中VEGF165b和VEGF165 蛋白表達(dá)水平(0.331±0.041和0.698±0.049)無明顯變化(P>0.05)。與空白組比較， PcDNA-VEGF165b組VEGF165b蛋白表達(dá)水平(0.969±0.081)明顯升高(P<0.01)，VEGF165蛋白表達(dá)水平(0.202±0.024)明顯降低 (P<0.01)。見圖2。

2.4 各組細(xì)胞遷移率與空白組(100.0%)比較，對照組HepG2細(xì)胞遷移率(98.1%±1.9%)無明顯變化(P>0.05)。與空白組和對照組比較，PcDNA-VEGF165b組HepG2細(xì)胞遷移率 (60.2%±9.1%)明顯降低(P<0.05)。

Lane 1： PcDNA-VEGF165b group；Lane 2：Control group；Lane 3：Blank group.

3 討 論

腫瘤的生長主要靠新生血管的生成，已經(jīng)有大量研究[4]報(bào)道:肝癌組織中VEGF過度表達(dá),且其過度表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)。VEGF有多種形式的剪接變異體：有促進(jìn)血管生成的VEGFxxx 家族和抑制血管生成的VEGFxxxb家族[5]，在VEGFxxxb家族中，VEGF165b在功能和體內(nèi)分布上都占有主導(dǎo)地位[6-7]。

VEGF165b可以抑制VEGF165介導(dǎo)的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成作用。VEGF165 通過激活血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)，促使細(xì)胞通過細(xì)胞外基質(zhì)遷移和凋亡[8-9]。VEGF165b 和VEGF165 具有相同的VEGFR-2結(jié)合親和力，但VEGF165b 競爭性結(jié)合了VEGFR-2后可以抑制VEGFR-2激活，進(jìn)而抑制VEGF165 介導(dǎo)的血管生成。研究[10]發(fā)現(xiàn)：VEGF165b在結(jié)腸直腸癌、腎癌、食管癌、前列腺癌和乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常組織，VEGF165b 表達(dá)下調(diào)可能成為判斷腫瘤預(yù)后的一個新指標(biāo)[11]。

本課題組前期研究[12]顯示：肝癌組織中VEGF165b表達(dá)明顯低于正常肝組織,而肝癌組織中VEGF165表達(dá)明顯高于正常肝組織，表明VEGF165b與肝癌的發(fā)生和發(fā)展具有密切關(guān)系。本研究合成了外源性重組VEGF165b，成功轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞，通過PCR、Western blotting和MTT等方法探討其對肝癌細(xì)胞的作用。本研究結(jié)果顯示：成功轉(zhuǎn)染構(gòu)建的PcDNA-VEGF165b 表達(dá)載體到HepG2細(xì)胞中，可以使VEGF165b mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增高，而VEGF165 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低。VEGF165b表達(dá)增高可以抑制HepG2細(xì)胞的遷移。本研究中MTT法檢測結(jié)果顯示：VEGF165b表達(dá)增高雖然可以使HepG2細(xì)胞的生存率有所降低，但與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與既往研究結(jié)果相似，但仍需大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證VEGF165b對HepG2細(xì)胞及其他腫瘤細(xì)胞增殖的影響。本課題組既往已經(jīng)證明VEGF165b在正常肝組織中有大量的表達(dá)，而其在肝癌組織中表達(dá)較正常肝組織中明顯減少，且已證明VEGF165b對肝癌細(xì)胞有生長抑制作用。VEGF165b 可以抗血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用[13]，可以通過提高表達(dá)VEGF165b、給予外源性重組VEGF165b 或促進(jìn)VEGF 外顯子8b選擇性剪接[14-16]，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。本研究為腫瘤的生物治療和靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和數(shù)據(jù)。

綜上所述，VEGF165b對VEGF165有抑制作用，VEGF165b表達(dá)增加對肝癌細(xì)胞的侵襲具有抑制作用。VEGF165b有希望成為判斷肝癌預(yù)后的指標(biāo)，并成為治療肝癌的靶向藥物。

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