張?zhí)m梨 張倩倩 陳 輝 王謝昊 吳振兵 馮宇晴 李愛華

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049;3. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430070; 4. 江蘇省漁業(yè)技術(shù)推廣中心, 南京 210036)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)屬于弧菌科氣單胞菌屬, 是一種革蘭氏陰性短桿菌, 廣泛分布于自然界各種水體及淤泥、土壤中, 對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物、畜禽和人均具有致病性[1—4], 尤其是對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物危害嚴(yán)重, 可導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物患敗血癥、腸炎、爛尾病、腹水病等[5], 造成水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

細(xì)菌生存和繁殖的前提是適應(yīng)環(huán)境[6], 這就需要細(xì)菌多種分子調(diào)控系統(tǒng)來(lái)有效整合外界信息并控制細(xì)菌行為應(yīng)對(duì)方式。細(xì)菌分子調(diào)控系統(tǒng)包括單組分、雙組分及三組分調(diào)控系統(tǒng), 其中雙組分調(diào)控系統(tǒng)處于中心地位。CpxRA系統(tǒng)是革蘭氏陰性菌中普遍存在的一種雙組分系統(tǒng), 由細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜上的組氨酸蛋白激酶CpxA和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白CpxR組成。當(dāng)CpxA蛋白感知到外界信號(hào)分子變化時(shí), 通過(guò)自磷酸化使一個(gè)保守的組氨酸殘基帶上磷酸基團(tuán), 然后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白CpxR的天冬氨酸殘基上, 磷酸化的CpxR被激活, 會(huì)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的特異序列結(jié)合, 激活轉(zhuǎn)錄[7]。已有學(xué)者對(duì)大腸桿菌、霍亂弧菌、遲緩愛德華氏菌等的CpxRA雙組分系統(tǒng)進(jìn)行深入研究, 但有關(guān)嗜水氣單胞菌中Cpx系統(tǒng)的作用則鮮有報(bào)道。因此本文通過(guò)構(gòu)建嗜水氣單胞菌株DBHS101的cpxRA雙基因缺失突變株Δcpx來(lái)研究Cpx系統(tǒng)在嗜水氣單胞菌的功能, 為后續(xù)深入認(rèn)識(shí)該系統(tǒng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株及質(zhì)粒

嗜水氣單胞菌DBHS101由本實(shí)驗(yàn)室于2009年6月在患病鳙魚腎臟分離得到[8], 具有氨芐青霉素抗性; 大腸桿菌S17-1λpir和pACYC184質(zhì)粒由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所謝海俠博士饋贈(zèng); pMD18-T質(zhì)粒購(gòu)自大連TaKaRa公司; pRE112質(zhì)粒由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)林蠡博士饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑和儀器

細(xì)菌基因組提取試劑盒、DNA Marker、2×TaqMasterMix購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于OMEGA公司; 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、SYBR GreenⅠ購(gòu)自大連TaKaRa公司; 蔗糖、氯霉素、氨芐青霉素購(gòu)自Sigma公司。PCR儀購(gòu)于Thermo公司; 核酸電泳儀購(gòu)于Bio-Rad公司; 引物合成于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司(表 1)。

1.3 基因缺失株及互補(bǔ)株的構(gòu)建和鑒定

基因缺失株的構(gòu)建和鑒定根據(jù)Ho等[9]的方法利用融合PCR獲得基因缺失片段, 通過(guò)同源重組篩選出缺失突變株。以嗜水氣單胞菌DBHS101的基因組為模板, 根據(jù)已公布的Aeromonas hydrophilaML09-119 (CP005966)、JBN2301 (CP013178)、NJ-35 (CP006870)全基因組序列, 同源克隆擴(kuò)增得到DBHS101的cpxRA基因簇全序列, 用Primer Premier 5.0對(duì)序列設(shè)計(jì)引物。用引物cpx-5O/5I和cpx-3I/3O分別擴(kuò)增cpx基因的上下游片段F1、F2,然后用F1、F2片段為模板, 用cpx-5O/3O進(jìn)行融合PCR得到大片段F1F2, 將F1F2片段連接到pMD18-T載體上送測(cè)序, 驗(yàn)證片段序列正確后, 在限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和KpnⅠ及T4 DNA連接酶的作用下將片段與自殺性質(zhì)粒pRE112連接起來(lái)構(gòu)建重組質(zhì)粒pRE-Δcpx; 把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-1λpir感受態(tài)中, 然后利用接合轉(zhuǎn)移法將重組質(zhì)粒pRE-Δcpx轉(zhuǎn)入受體菌DBHS101中進(jìn)行同源重組, 通過(guò)含氨芐青霉素(Amp 100 μg/mL)、氯霉素(Cm 25 μg/mL)或蔗糖(SacB 0.1 g/mL) 的TSA平板篩選出SacBRCms表型菌株, 即為陽(yáng)性菌株, 用cpx-5O/3O及兩對(duì)檢測(cè)引物cpx-outcheck F/R、cpx-incheck F/R對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證, 條帶大小符合期望值的即為cpxR-A基因缺失突變株Δcpx。雙交換及篩選過(guò)程如圖1。

互補(bǔ)株CΔcpx的構(gòu)建以DBHS101的基因組為模板, 用互補(bǔ)引物com-F/com-R擴(kuò)增cpx互補(bǔ)片段, 連T載測(cè)序正確后經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ 和SphⅠ 雙酶切后連接pACYC184載體構(gòu)成互補(bǔ)質(zhì)粒pACYC-cpx, 互補(bǔ)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入缺失突變株Δcpx中,即可構(gòu)建互補(bǔ)株, 經(jīng)氯霉素抗性平板篩選和PCR驗(yàn)證挑出陽(yáng)性克隆, 送測(cè)序。

1.4 掃描電鏡觀察

劃線后分別挑取野生株、突變株和互補(bǔ)株的單菌落在TSB中過(guò)夜培養(yǎng), 按照1%比例轉(zhuǎn)接至底部放有蓋玻片的新鮮的TSB培養(yǎng)基中, 28℃靜置培養(yǎng)24h, 取出蓋玻片用無(wú)菌PBS沖洗3次; 接著用2.5%戊二醛4℃固定4h, 之后依次用10%、30%、50%、70%、90%和無(wú)水乙醇脫水, 叔丁醇進(jìn)行置換, 最后真空冷凍干燥, 噴金進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.5 生長(zhǎng)曲線、運(yùn)動(dòng)能力及生物膜形成能力測(cè)定

挑取野生株、突變株的單菌落在5 mL TSB中過(guò)夜培養(yǎng), 調(diào)節(jié)吸光度值A(chǔ)600=1.0, 按照1%比例分別轉(zhuǎn)接至新鮮的TSB培養(yǎng)基中28℃ 180 r/min進(jìn)行振蕩培養(yǎng), 每1h取樣測(cè)定OD600, 連續(xù)觀察12h并繪制生長(zhǎng)曲線; 當(dāng)菌株長(zhǎng)至A600=1.0時(shí), 取2 μL接種至含0.35%瓊脂的半固體TSB平板, 28℃ 靜置培養(yǎng)24h后觀察并測(cè)量泳動(dòng)圈大小; 采用96孔法[10]進(jìn)行生物膜的測(cè)定, 在菌株按照1%比例轉(zhuǎn)接至新鮮TSB后, 立即將含菌的培養(yǎng)基以200 μL/孔的量轉(zhuǎn)移到三個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 分別在24h、48h、96h各取出一板, 棄掉培養(yǎng)基, 用PBS洗滌3次自然風(fēng)干后, 以Bouin’s固定液固定1h之后加入1%結(jié)晶紫染液, 染色30min。最后用蒸餾水洗滌3次, 待干燥后加入95%乙醇溶解, 靜置10min; 以無(wú)菌培養(yǎng)基做空白對(duì)照, 用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)(結(jié)晶紫最大吸收波長(zhǎng))各孔的光吸收值從而比較生物膜含量差異。

表 1 本研究中使用的引物Tab. 1 Primers used in this study

圖1 cpxR-A基因缺失株的構(gòu)建過(guò)程Fig. 1 Construction of cpxR-A mutant strain

1.6 刺激耐受實(shí)驗(yàn)

急性刺激挑野生株和突變株的單菌落活化后按照1%比例擴(kuò)大培養(yǎng)至A600=0.5, 4℃ 8000×g離心5min, 加入TSB重懸; 之后取100 μL菌液加入到900 μL TSB (對(duì)照組)或含刺激因子的TSB (實(shí)驗(yàn)組)中, 28℃, 180 r/min培養(yǎng)30min; 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別用TSB進(jìn)行連續(xù)十倍倍比稀釋, 每個(gè)濃度稀釋液各取10 μL在含Amp的TSA平板上點(diǎn)樣[11], 28℃培養(yǎng)12—14h后計(jì)數(shù), 比較野生株和突變株的存活率差異(存活率%=實(shí)驗(yàn)組CFU/對(duì)照組CFU×100%)。

刺激因子及終濃度0.02 mol/L HCl、0.02 mol/L NaOH、0.5 mol/L KCl、0.5 mg/mL SDS、5 mg/mL EDTA，2 μm孔徑濾膜過(guò)濾除菌。

慢性刺激挑單菌落活化后, 培養(yǎng)至A600=1.0時(shí), 按照1%比例轉(zhuǎn)接至30 mL含刺激因子的TSB培養(yǎng)基(對(duì)照組不含刺激因子)中28℃ 180 r/min培養(yǎng)12h, 每小時(shí)測(cè)定A600值。刺激因子及終濃度5 mg/mL EDTA溶液, 20 μg/mL多黏菌素B溶液。

1.7 致病性相關(guān)實(shí)驗(yàn)

斑馬魚浸泡感染實(shí)驗(yàn)挑取野生株和突變株的單菌落活化后擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期, 用PBS洗滌3次后調(diào)節(jié)菌液濃度為108CFU/mL, 分別用1 L的野生株、突變株菌懸液或PBS各浸泡15條健康斑馬魚24h, 之后每天正常換水, 但不喂食觀察1周內(nèi)魚的生長(zhǎng)狀態(tài)及存活情況。

斑馬魚腹腔注射攻毒實(shí)驗(yàn)挑取野生株和突變株的單菌落活化后擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(培養(yǎng)約2.5h), 用PBS調(diào)節(jié)菌液濃度(野生株濃度分別是1.29×105、6.45×104、3.23×104和1.62×104CFU/mL;突變株濃度為1.32×105、6.59×104、3.30×104和1.65×104CFU/mL)[12], 然后各取50 μL分別腹腔注射斑馬魚(平均長(zhǎng)度為3 cm, 隨機(jī)分為9組, 每組15條)對(duì)照組注射等量PBS, 統(tǒng)計(jì)2周內(nèi)斑馬魚存活情況, 根據(jù)軟件SPSS 16.0 通過(guò)幾率單位加權(quán)回歸法(Bliss)計(jì)算斑馬魚半數(shù)致死量LD50。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Cpx系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)量的變化, 篩選了與Cpx系統(tǒng)可能相關(guān)的基因序列設(shè)計(jì)引物[11,13,14](表 2)進(jìn)行熒光定量分析。培養(yǎng)野生株和突變株至對(duì)數(shù)期, 然后提細(xì)菌RNA, 測(cè)定其濃度及電泳檢測(cè)質(zhì)量后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 以野生株作為對(duì)照組,選取穩(wěn)定表達(dá)的16S rRNA基因作內(nèi)參, 進(jìn)行熒光定量PCR。反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn), 選取5 mg/mL EDTA作為誘導(dǎo)劑, 當(dāng)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期(A600為0.2—0.3)時(shí), 加入EDTA溶液或等量無(wú)菌雙蒸水(對(duì)照組), 繼續(xù)培養(yǎng)30min, 提取細(xì)菌RNA, 迅速反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后,選取外膜相關(guān)的5個(gè)基因進(jìn)行熒光定量PCR, 比較野生株、突變株中這些基因經(jīng)EDTA處理后的表達(dá)量變化。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL: SYBR GreenⅠMix 10 μL, 上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, 模板cDNA 1 μL, DEPC H2O 7.4 μL。

PCR反應(yīng)條件為: 95℃ 預(yù)變性2min; 95℃ 變性10s, 58℃ 退火30s, 72℃ 延伸30s, 40個(gè)循環(huán)。

野生株和突變株各3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 每1個(gè)樣品重復(fù)3次, 基因轉(zhuǎn)錄水平的變化根據(jù)2-ΔΔCt方法[15]計(jì)算。

表 2 熒光定量PCR引物Tab. 2 Primers used in qRT-PCR

1.9 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖通過(guò)GraphPad Prism 5.01繪制, 采用雙尾t檢驗(yàn)方法, 但斑馬魚浸泡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果采用的是log-rank (Mantel-Cox) 檢驗(yàn), 顯著性水平定義為P＜0.05, 在圖中用“*”標(biāo)出,P＜0.01, 用“**”標(biāo)出。

2 結(jié)果

2.1 基因缺失株、互補(bǔ)株的鑒定

以嗜水氣單胞菌野生株DBHS101為模板, 通過(guò)PCR分別獲得cpxRA基因的上下游同源臂F1、F2(理論值F1=646 bp F2=505 bp), 然后進(jìn)行融合PCR得到缺失cpxRA基因部分片段的上下游片段F1F2 (理論值F1F2=1116 bp), 結(jié)果如圖2A所示。對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行XbaⅠ/KpnⅠ雙酶切驗(yàn)證(圖2B)并送測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果正確。通過(guò)接合轉(zhuǎn)移和同源重組, 在氨芐、蔗糖和氯霉素的壓力條件下逐步篩選得到了嗜水氣單胞菌cpxRA基因缺失株Δcpx,以cpx-incheck F/R、cpx-5O/3O、cpx-outcheck F/R三對(duì)引物同時(shí)對(duì)野生株和突變株進(jìn)行PCR驗(yàn)證,結(jié)果如圖2C所示, 和理論值相符(理論值: 野生株做模板時(shí)3對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小應(yīng)該為2649、2921和3325 bp, 陽(yáng)性突變株做模板3對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小應(yīng)該為826、1116和1501 bp), 說(shuō)明構(gòu)建的缺失株Δcpx正確。

以嗜水氣單胞菌野生株DBHS101為模板, 以com-F/com-R為引物擴(kuò)增得到cpxRA互補(bǔ)片段, 將片段與質(zhì)粒pACYC184酶切連接后電轉(zhuǎn)入突變株Δcpx中, 篩選在含Cm的TSA平板上生長(zhǎng)的單菌落,以com-F/com-R為引物, 野生株和突變株為對(duì)照進(jìn)行PCR來(lái)驗(yàn)證, 結(jié)果如圖3所示, 符合預(yù)期值(理論值: 野生株為模板時(shí)PCR產(chǎn)物應(yīng)該為2238 bp, 突變株為模板時(shí)PCR產(chǎn)物應(yīng)該為415 bp), 將互補(bǔ)株P(guān)CR產(chǎn)物送測(cè)序, 序列正確, 說(shuō)明互補(bǔ)株CΔcpx構(gòu)建成功。

2.2 掃描電鏡觀察

載有菌液的玻片在固定、冷凍、干燥后用掃描電鏡進(jìn)行觀察, 結(jié)果如圖4(進(jìn)行了3次重復(fù), 未顯示所有重復(fù)圖), 結(jié)果顯示在20000倍放大下, 野生株、突變株和互補(bǔ)株的形態(tài)沒有明顯差異。

圖2 基因缺失株的構(gòu)建和鑒定Fig. 2 Construction and identification of cpxRA mutant strain

圖3 互補(bǔ)株的鑒定Fig. 3 Identification of cpxRA complementary strain

圖4 菌株掃描電鏡圖Fig. 4 SEM images of strains

2.3 生長(zhǎng)曲線、運(yùn)動(dòng)能力及生物膜形成能力測(cè)定結(jié)果

野生株和缺失株生長(zhǎng)曲線如圖5A, 兩者的生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯差異, 說(shuō)明cpxRA基因同時(shí)缺失不影響嗜水氣單胞菌DBHS101正常條件下的生長(zhǎng); 運(yùn)動(dòng)能力結(jié)果如圖5B, 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 野生株、缺失株和互補(bǔ)株間泳動(dòng)能力無(wú)明顯差異。

在生物膜形成能力測(cè)定中, 通過(guò)測(cè)定生物膜吸附的結(jié)晶紫含量來(lái)分析菌株在靜置培養(yǎng)24h、48h和96h后形成的生物膜濃度, 結(jié)果如圖6所示, 突變株生物膜形成能力較野生株稍低, 且在96h兩者差距更大, 但沒有達(dá)到顯著性水平; 而互補(bǔ)株則在24h時(shí)與野生株相似, 但在48h、96h菌膜形成較野生株少,這可能是因?yàn)楹笃诰隊(duì)I養(yǎng)缺乏時(shí)互補(bǔ)株表達(dá)抗性基因會(huì)耗用能量。從總的結(jié)果分析,cpxRA基因簇對(duì)生物膜形成有一定作用但不是其關(guān)鍵因子。

圖5 菌株的生長(zhǎng)曲線及泳動(dòng)直徑Fig. 5 The growth curve of strains and motility assays

圖6 生物膜形成能力Fig. 6 The assay of biofilm formation

2.4 刺激耐受實(shí)驗(yàn)

急性刺激實(shí)驗(yàn)分別選取酸性、堿性、高滲透壓及去污劑和螯合劑刺激作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 比較這些刺激對(duì)野生株和缺失株存活率的影響, 從而了解Cpx系統(tǒng)和這些刺激應(yīng)對(duì)機(jī)制間的關(guān)系。結(jié)果如圖7, 去污劑SDS存在環(huán)境下突變株較野生株存活率顯著增加, 而高滲透壓環(huán)境下突變株相比于野生株存活率則是顯著下降的, 在其他環(huán)境中兩者差異不顯著, 這說(shuō)明在嗜水氣單胞菌中Cpx雙組分系統(tǒng)參與細(xì)菌對(duì)高滲透壓和SDS刺激的應(yīng)答。

慢性刺激實(shí)驗(yàn)為了了解菌株對(duì)刺激的一個(gè)動(dòng)態(tài)反應(yīng)過(guò)程, 采用了測(cè)定吸光度值繪制生長(zhǎng)曲線的方法來(lái)觀察突變株和野生株對(duì)影響外膜結(jié)構(gòu)的刺激的表現(xiàn)。結(jié)果如圖8所示, 可以看出野生株和突變株在這2種刺激條件下生長(zhǎng)情況有著顯著差異, 在觀察的12h內(nèi), 突變株在含有EDTA的環(huán)境中依然能緩慢生長(zhǎng), 而野生株則一直處于生長(zhǎng)停滯狀態(tài); 在多黏菌素B刺激下, 突變株反而停滯生長(zhǎng), 而野生株則是持續(xù)生長(zhǎng)。

2.5 毒力試驗(yàn)結(jié)果

斑馬魚浸泡攻毒試驗(yàn)以108CFU/mL濃度的野生株和缺失株菌液1 L同時(shí)各浸泡15條健康斑馬魚24h, 之后每天換水, 觀察1周內(nèi)斑馬魚的存活情況, 以PBS做空白對(duì)照。1周后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制斑馬魚累積存活曲線(圖9)并用log-rank (Mantel-Cox)檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析, 結(jié)果顯示通過(guò)菌液浸泡感染, 野生株對(duì)斑馬魚毒力較缺失株較大, 但差異不顯著(P=0.283＞0.05)。

圖7 不同急性刺激下菌株存活率Fig. 7 The survival of strains in different acute stimulus

圖8 在不同刺激下菌株的生長(zhǎng)曲線Fig. 8 The growth curve of strains in different stimulus

斑馬魚腹腔注射攻毒試驗(yàn)分別用4個(gè)濃度菌液各50 μL腹腔注射斑馬魚(n=15), 同時(shí)以PBS作對(duì)照。斑馬魚死亡情況如表 3, 經(jīng)計(jì)算LD50(wild)=6.19×102cfu/尾,LD50(Δcpx)= 7.00×102cfu/尾, 說(shuō)明野生株和缺失株腹腔注射對(duì)斑馬魚的毒力均很強(qiáng),并且缺失株毒力較野生株稍弱。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

提取細(xì)菌對(duì)數(shù)期的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 然后選取嗜水氣單胞菌毒力蛋白基因、其他雙組分系統(tǒng)基因及菌毛基因等共15個(gè)基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè), 結(jié)果如圖10。通過(guò)熒光定量PCR, 再次驗(yàn)證了突變株的cpxR和cpxA基因缺失, 并且可以看到突變株的毒力基因hly、aer、alt相比野生株顯著上調(diào), 但幅度不大; 另外可以發(fā)現(xiàn)CpxRA雙組分系統(tǒng)的缺失會(huì)導(dǎo)致OmpR-EnvZ雙組分系統(tǒng)上調(diào), 說(shuō)明CpxRA雙組分系統(tǒng)可能和OmpR-EnvZ在功能上存在協(xié)調(diào)關(guān)系; 但CpxRA缺失對(duì)QseBC無(wú)顯著影響,QseBC雙組分系統(tǒng)與生物膜形成相關(guān), 這和前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致, 說(shuō)明cpxRA基因簇缺失對(duì)細(xì)菌生物膜形成影響不大; 當(dāng)加入誘導(dǎo)劑EDTA后, 菌株的部分基因表達(dá)如圖11所示, 經(jīng)EDTA處理0.5h后, 野生株和突變株dsbA/exbD1/histidine kinase gene (AHML_03870)/hly基因均上調(diào)表達(dá), 其中有顯著差異的是exbD1和histidine kinase gene。

3 討論

圖9 斑馬魚浸泡攻毒累積存活曲線Fig. 9 The survival curve of zebrafish attacked by Aeromonas hydrophila strains soak

表 3 斑馬魚腹腔注射累積死亡情況Tab. 3 The cumulative death of zebrafish injected A. hydrophila strains by intraperitoneal

圖10 相關(guān)基因表達(dá)量變化Fig. 10 Related genes expression level

自從1980年McEwen等[16]研究大腸桿菌基因缺失株特征時(shí)發(fā)現(xiàn)CpxRA系統(tǒng), 這個(gè)雙組分系統(tǒng)逐漸受到研究者的關(guān)注, 它的生物功能在越來(lái)越多的細(xì)菌中被揭示。Cosma等[17]研究發(fā)現(xiàn)Cpx系統(tǒng)的激活能緩和膜蛋白的錯(cuò)誤折疊; De Wulf等[18,19]認(rèn)為cpx系統(tǒng)能使細(xì)菌獲得對(duì)不良應(yīng)激的抵抗力; Gal-Mor等[20]研究表明Cpx系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)毒力基因icm和dot的表達(dá);Jubelin等[21]研究發(fā)現(xiàn), Cpx系統(tǒng)可以調(diào)控大腸桿菌菌毛的合成, 間接影響病原菌的粘附和侵襲。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)融合PCR構(gòu)建嗜水氣單胞菌CpxRA雙基因缺失片段, 利用自殺質(zhì)粒pRE112和同源重組獲得cpx缺失突變株Δcpx來(lái)研究Cpx系統(tǒng)在嗜水氣單胞菌中的作用。

結(jié)果顯示突變株的外部形態(tài)以及在正常環(huán)境下攝取養(yǎng)分生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、形成生物膜和野生株相比沒有顯著差異, 這說(shuō)明cpxRA基因缺失對(duì)這些過(guò)程的影響程度較小; 斑馬魚腹腔注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示野生株和缺失株相對(duì)于斑馬魚而言均為強(qiáng)毒株, 兩者毒力沒有明顯差異, 而在浸泡感染過(guò)程中, 缺失株毒力較野生株稍弱, 但差異還沒有達(dá)到顯著水平。因此我們推測(cè)cpxRA基因簇不是主要毒力基因。在這些結(jié)果中, 突變株和野生株表現(xiàn)一致, 根據(jù)qRT-PCR比較, 可能有2種原因, 一種是cpxRA基因簇確實(shí)不參與嗜水氣單胞菌的這些過(guò)程, 對(duì)毒力基因影響也不大; 另一種可能是CpxRA被敲除后,有其他系統(tǒng)取代了該系統(tǒng)在這些過(guò)程中的作用, 因而細(xì)菌表現(xiàn)與野生株無(wú)差異, 可以看到突變株的ompR、envZ雙組分系統(tǒng)基因以及經(jīng)EDTA誘導(dǎo)后類似于CpxA的組氨酸激酶(AHML_03870)是上調(diào)的, 這說(shuō)明這些基因是受Cpx系統(tǒng)影響的[22]。

圖11 加入EDTA誘導(dǎo)劑后菌株熒光定量結(jié)果Fig. 11 The result of qRT-PCR after EDTA induction

在急性刺激實(shí)驗(yàn)中, 突變株在0.5 mg/mL SDS刺激下存活率顯著高于野生株, 而在0.5 mol/L KCl的高滲透壓環(huán)境下則是顯著低于野生株的; 同樣的, 當(dāng)給予慢性刺激時(shí), 突變株在5 mg/mL的EDTA刺激下存活率顯著高于野生株, 在20 μg/mL多黏菌素B刺激下甚至停滯生長(zhǎng)。這些結(jié)果說(shuō)明Cpx雙組分系統(tǒng)參與嗜水氣單胞菌對(duì)外界刺激的應(yīng)答, 且對(duì)不同刺激的表現(xiàn)不同。突變株在SDS刺激反應(yīng)中存活率較野生株高, 這可能是因?yàn)镃px系統(tǒng)增加細(xì)菌對(duì)SDS的敏感性, 所以當(dāng)失去這個(gè)系統(tǒng)后, 細(xì)菌敏感性反而減弱, 但這也許會(huì)對(duì)突變株其他方面帶來(lái)不利; 突變株在高滲透條件下存活率顯著降低表明Cpx系統(tǒng)參與嗜水氣單胞菌抗高滲透壓的調(diào)控過(guò)程。對(duì)于EDTA刺激, 綜合急性和慢性刺激結(jié)果: 短時(shí)間的刺激沒有明顯降低菌株的存活率, 當(dāng)刺激時(shí)間延長(zhǎng)至12h, 野生株生長(zhǎng)停滯, 突變株表現(xiàn)出緩慢生長(zhǎng), 由此說(shuō)明5 mg/mL濃度的EDTA對(duì)菌株并不會(huì)帶來(lái)明顯致死效應(yīng), 但這種刺激環(huán)境的持續(xù)會(huì)干擾菌株的正?；顒?dòng)過(guò)程, 突變株由于缺少Cpx系統(tǒng),對(duì)這種刺激反應(yīng)遲鈍, 因而生長(zhǎng)較快, 但EDTA對(duì)細(xì)菌的累積損傷可能會(huì)造成突變株其他方面如離子吸收的改變。在熒光定量實(shí)驗(yàn)中, 經(jīng)EDTA誘導(dǎo)后野生株exbD1基因的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)高達(dá)62.7, 是突變株上調(diào)的3倍多,exbD1基因編碼的蛋白是ExbBExbD-TonB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一部分, 該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是能量依賴的運(yùn)輸外界陽(yáng)離子進(jìn)入機(jī)體進(jìn)行生命活動(dòng)的一個(gè)通道[23,24]。野生株在受刺激后大量表達(dá)exbD1基因, 有助于機(jī)體同EDTA爭(zhēng)奪陽(yáng)離子, 為細(xì)菌的大量繁殖做準(zhǔn)備。多黏菌素B刺激結(jié)果說(shuō)明野生株DBHS101對(duì)20 μg/mL多黏菌素B有一定耐藥性, 突變株在這種條件下生長(zhǎng)停滯可能是因?yàn)槿笔px雙組分系統(tǒng), 機(jī)體不能迅速啟動(dòng)耐藥機(jī)制所以生長(zhǎng)受阻, 由此我們推測(cè)Cpx系統(tǒng)參與多黏菌素B耐藥過(guò)程, 當(dāng)然這還需要后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明敲除cpxRA基因簇并不影響嗜水氣單胞菌DBHS101毒力, 這與沙門氏菌[25]、大腸桿菌[26]等是不同的; 因此我們需要從嗜水氣單胞菌的不同雙組分系統(tǒng)間的關(guān)系及毒力基因表達(dá)譜方面繼續(xù)探究來(lái)分析原因; 此外比較缺失突變株在其他環(huán)境壓力、代謝等方面與野生株的差異來(lái)系統(tǒng)了解Cpx在嗜水氣單胞菌中發(fā)揮的功能也是后續(xù)值得討論的問題。

[1]Thune R L, Stanley L A, Cooper R K. Pathogenesis of gram-negative bacterial infections in warm water fish [J].Annual Reviews of Fish Diseases, 1993, 3: 145—185

[2]Popoff M. Aeromonas. Krieg N R, editor. Bergy’s Manual of Systematic Bacteriology, vol. 1. Baltimore [M]. Williams &Wilkins, 1984, 545—548

[3]Altwegg M, Geiss H K. Aeromonas as a human pathogen[J].Critical Reviews in Microbiology, 1989, 16: 253—286

[4]Austin B, Austin D A. Bacterial fish pathogens. Disease of Farmed and Wild Fish [M]. 5th ed Chichester: Springer Praxis, 2012, 119—146

[5]Cipriano R C.Aeromonas hydrophilaand Motile Aeromonad Septicemias of Fish [M]. Fish Disease Leaflet, 2001, 68

[6]Conrad M. Cross-scale information processing in evolution, development and intelligence [J].Biosystems, 1996,38(2—3): 97—109

[7]Raivio T L, Silhavy T J. Transduction of envelope stress in Escherichia coli by the Cpx two-component system [J].Journal of Bacteriology, 1997, 179(24): 7724—7733

[8]Zhang X J, Yang W M, Li T T,et al. The genetic diversity and virulence characteristics ofAeromonas hydrophilaisolated from fishponds with disease outbreaks in Hubei province [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2013,37(3): 458—466 [張旭杰, 楊五名, 李彤彤, 等. 湖北地區(qū)暴發(fā)病池塘中嗜水氣單胞菌的遺傳多樣性和毒力特征研究. 水生生物學(xué)報(bào), 2013, 37(3): 458—466]

[9]Ho S N, Hunt H D, Horton R M,et al. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chainreaction [J].Gene, 1989, 77(1): 51—59

[10]Hu Y H, Liu C S, Hou J H,et al. Identification, characterization, and molecular application of a virulence-associated autotransporter from a pathogenic Pseudomonas fluorescens strain [J].Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(13): 4333—4340

[11]Kristin S, Emina C, Elke H,et al. Molecular and proteome analyses highlight the importance of the Cpx envelope stress system for acid stress and cell wall stability inEscherichia coli[J].Microbiology Open, 2016, 5(4): 582—596

[12]Li A H. The study of the drug resistance, resistance plasmid of fish pathogenic bacteria, and the antibacterial action of several drug in China [D]. Ph D thesis, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan.1998 [李愛華. 我國(guó)魚類病原菌耐藥性、耐藥質(zhì)粒及幾種藥物抗菌作用的研究. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所博士學(xué)位論文. 武漢. 1998]

[13]Acosta N, Pukatzki S, Raivio T L. TheVibrio choleraeCpx envelope stress response senses and mediates adaptation to low iron [J].Journal of Bacteriology, 2015, 197:262—276

[14]Raivio T L, Leblanc S K, Price N L,et al. The Escherichia coli Cpx envelope stress response regulates genes of diverse function that impact antibiotic resistance and membrane integrity [J].Journal of Bacteriology, 2013,195: 2755—2767

[15]Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-ΔΔCt)method [J].Methods, 2001, 25(4): 402—408

[16]McEwen J, Silverman P. Chromosomal mutations of Escherichia coli that alter expression of conjugative plasmid functions [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1980, 77:513—517

[17]Cosma C L, Danese P N, Carlson J H,et al. Mutational activation of the Cpx signal transduction pathway ofEscherichia colisuppresses the toxicity conferred by certain envelope-associated stresses [J].Molecular Microbiology, 1995, 18: 491—505

[18]De W P, Lin E C. Cpx Two-Component Signal Transduction in Escherichia coli: Excessive CpxR-P levels underlie CpxA* phenotypes [J].Journal of Bacteriology, 2000,182(5): 1423—1426

[19]De W P, Kwon O, Lin E C. The CpxRA signal transduction system ofEscherichia coli: Growth-related autoactivation and control of unanticipated target operons [J].Journal of Bacteriology, 1999, 181(21): 6772—6778

[20]Gal-Mor O, Segal G. Identification of cpxR as a positive regulator of icm and dot virulence genes ofLegionella pneumophila[J].Journal of Bacteriology, 2003, 185(16):4908—4919

[21]Jubelin G, Vianney A, Beloin C,et al. Cpx R/Omp R interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity inEscherichia coli[J].Journal of Bacteriology,2005, 187(6): 2038—2049

[22]Gerken H, Misra R. MzrA-EnvZ interactions in the periplasm influence the EnvZ/OmpR two-component regulon[J].Journal of Bacteriology, 2010, 192(23): 6271—6278

[23]Blanvillain S, Meyer D, Boulanger A,et al. Plant carbohydrate scavenging through tonB-dependent receptors: a feature shared by phytopathogenic and aquatic bacteria[J].PLoS One, 2007, 2: e224

[24]Schauer K, Gouget B, Carrière M,et al. Novel nickel transport mechanism across the bacterial outer membrane energized by the TonB/ExbB/ExbD machinery [J].Molecular Microbiology, 2007, 63: 1054—1068

[25]Humphreys S, Rowley G, Stevenson A,et al. Role of the two-component regulator Cpx AR in the virulence of Salmonella entetica serotype typhimurium [J].Infection andImmunity, 2004, 72(8): 4654—4661

[26]Debnath I, Norton J P, Barber A E,et al. The Cpx stress response system potentiates the fitness and virulence of uropathogenicEscherichia coli[J].Infection and Immunity, 2013, 81(5): 1450—1459