林裕勝,江錦秀,張靖鵬,游 偉,毛坤明,胡奇林

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,福建 福州 350013;2.福建省福清市畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心,福建 福清 350300)

2017年10月福清市某山羊養(yǎng)殖場發(fā)生了以流鼻涕、呼吸困難為主要特征的傳染病,其中1～6月齡小羊病死率高達(dá)50%以上。通過臨床癥狀、剖檢病變和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn),確診為山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus,ENTV)、綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)和溶血性曼氏桿菌(Mannheimia haemolytica,Mh)混合感染引起的山羊呼吸道疾病,診斷過程報(bào)告如下。

1 發(fā)病情況

福清市某農(nóng)戶共飼養(yǎng)的福清山羊127只,以山丘放牧為主。2017年5～6月份陸續(xù)出現(xiàn)6只1～8月齡左右山羊發(fā)病,表現(xiàn)為流鼻涕、咳嗽和呼吸困難,7月份出現(xiàn)20只3～6月齡山羊發(fā)病,主要表現(xiàn)為被毛粗亂,采食量減少、消瘦、流鼻涕、咳嗽,發(fā)病后期,羊鼻甲骨軟化,用手按即可凹陷。到10月23日,已有32只山羊發(fā)病,主要以羔羊?yàn)橹?2～6月齡羊發(fā)病28只,成年羊發(fā)病4只。這次疫情共發(fā)病32只,發(fā)病率為25.19%,17頭出現(xiàn)死亡,死亡率為53.13%。該羊場發(fā)病早期已用青霉素、鏈霉素、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉、板藍(lán)根、魚腥草等抗生素和中草藥進(jìn)行治療,無明顯好轉(zhuǎn)。據(jù)了解該場使用過三聯(lián)四防、口蹄疫疫苗、小反芻獸疫疫苗、傳染性胸膜肺炎疫苗等進(jìn)行免疫。

2 剖檢病變

筆者對送檢的3只病羊進(jìn)行剖檢,發(fā)現(xiàn)病羊的肺臟與肋骨粘連,肺部兩側(cè)邊緣呈“肉變”,肺小葉間質(zhì)增寬,其中1只腹腔內(nèi)有少量積液;鋸開頭部,3只病羊左、右兩側(cè)鼻道內(nèi)均可有灰白色息肉狀物,表面光滑,呈透明狀;其他臟器未見明顯病變(見中插彩版圖1、圖2)。

3 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)

3.1 細(xì)菌和支原體分離鑒定 取病死羊的鼻內(nèi)容物、肺臟組織和腹腔滲出物,在血瓊脂平板上劃線進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)和純化,于37℃的恒溫培養(yǎng)24 h。同時(shí)對采集的鼻內(nèi)容物和肺臟進(jìn)行剪碎、研磨,加0.01 mol/L pH值7.2 PBS緩沖液制成10%勻漿,經(jīng)離心后上清液進(jìn)行支原體分離培養(yǎng)。并對病原菌的16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序。結(jié)果在平板上生長出針尖樣大小、光滑的菌落。對分離菌16S rRNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,擴(kuò)增出了目的片段,將分離菌的16S rRNA的序列在GenBank上進(jìn)行比對,菌株與溶血性曼氏桿菌的同源性為100%,故分離菌為溶血性曼氏桿菌;支原體分離培養(yǎng)后經(jīng)本研究室建立的三重PCR檢測方法進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果顯示Mo陽性,Mmc和Mccp陰性,表明分離支原體為Mo。

3.2 病毒PCR檢測 對采集的鼻內(nèi)容物和肺臟進(jìn)行剪碎、研磨,加0.01 mol/L pH值7.2 PBS緩沖液制成10%勻漿,利用生工組織和病毒RNA提取試劑盒提取研磨樣品中的RNA,應(yīng)用參考文獻(xiàn)[1]建立羊口瘡病毒和 ENTV PCR方法進(jìn)行檢測。PCR結(jié)果顯示：ENTV的檢測結(jié)果為陽性,羊口瘡病毒檢測結(jié)果為陰性。

4 診斷結(jié)果

根據(jù)臨床癥狀、剖檢病變、流行病學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果等綜合判斷,確診該山羊養(yǎng)殖場山羊本次發(fā)病是由于ENTV、Mo和Mh混合感染所致。

5 討論

山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤是由ENTV-2引起的一種慢性、進(jìn)行性、接觸性傳染病,該病主要臨床特征表現(xiàn)為食欲減退,呼吸困難,鼻漏,出現(xiàn)單側(cè)或兩側(cè)性增生物;該病呈世界性分布,其發(fā)病率為0.5%～15%[3],致死率為100%。該羊場的發(fā)病率高達(dá)25.19%,且多以羔羊?yàn)橹?比文獻(xiàn)報(bào)道的發(fā)病率還要高。Mo是羊支原體性肺炎的主要病原之一,其臨床癥狀表現(xiàn)為高熱、咳嗽、喘氣、漸進(jìn)性消瘦、肺和胸膜發(fā)生漿液性和纖維素性炎癥,病死率一般為30% ～50%,有的高達(dá)80% ～100%[4-5]。有文獻(xiàn)報(bào)道綿羊肺炎支原體感染山羊后,會導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷,使得溶血性曼氏桿菌、巴氏桿菌等細(xì)菌和病毒更容易侵入機(jī)體,造成混合感染。近年來Bessent、Rohana、李君璞均有報(bào)道綿羊肺炎支原體和溶血性曼氏桿菌混合感染的病例[6-8],未見 ENTV、Mo和 Mh同時(shí)感染山羊的報(bào)道。

在本次病例中,我們通過對病料進(jìn)行細(xì)菌分離、PCR擴(kuò)增和測序分析,成功分離到了1株Mh;通過支原體分離培養(yǎng)和PCR檢測,分離到了1株Mo;通過參考文獻(xiàn)合成引物對羊口瘡病毒和ENTV進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測到了ENTV陽性;同時(shí)結(jié)合該病例臨床上主要癥狀、剖檢病變和流行病學(xué)等特點(diǎn),確認(rèn)該病例是由ENTV、Mo和Mh三種病原體混合感染所致。本病例表明引起山羊呼吸道疾病的病原體已經(jīng)不單是支原體或者細(xì)菌的單一感染或者混合感染,已出現(xiàn)病毒、支原體和細(xì)菌三者混合感染的現(xiàn)象,使羊的疫病更加復(fù)雜化。

綜上所述,ENTV、Mo和Mh可混合感染山羊引起嚴(yán)重的呼吸道疾病,對山羊養(yǎng)殖業(yè)形成嚴(yán)重威脅。因此,在山羊養(yǎng)殖過程中,除了注重防控口蹄疫、小反芻獸疫、山羊傳染性胸膜肺炎等重大疫病外,還需注重對Mo、Mh和ENT的防控,因?yàn)檫@3種病原之間是哪一個(gè)是主要病原目前尚未有這方面的研究,并且國內(nèi)外目前尚無ENT的有效疫苗和治療藥物,最有效的措施是凈化,通過撲殺病羊及帶毒羊的方法來控制該病。因此除了加強(qiáng)羊群的防疫工作,還應(yīng)避免天氣變化等因素造成的應(yīng)激和免疫功能降低從而引起繼發(fā)感染。