李艷玲,盧婷婷,劉永錄,張國祖

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院制藥工程學(xué)院,河南 鄭州 450046)

白頭翁散由白頭翁、黃連、黃柏和秦皮組成。其功效為清熱解毒,涼血止痢。主治：熱毒赤痢,濕熱痢疾,赤多白少和發(fā)熱口渴等[1]。在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用非常廣泛。但作為散劑,藥材的吸收利用率較低,臨床用量較大,對藥材資源造成了很大的浪費。

超微粉碎技術(shù)是近20年來國際上發(fā)展起來的一項應(yīng)用現(xiàn)代物理或化學(xué)方法對材料進行微粉化的新技術(shù),已廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品、涂料等眾多領(lǐng)域[2]。超微粉碎技術(shù)應(yīng)用到中藥制劑中同樣顯示出獨特的優(yōu)勢,研究結(jié)果表明,中藥粉碎成超微粉后與用傳統(tǒng)散劑相比,可明顯提高藥效和產(chǎn)品質(zhì)量。目前,獸藥市場上也出現(xiàn)了很多超微粉的中成藥,但沒有統(tǒng)一的檢測方法,因為沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),所以造成了市場上的魚目混珠,以普通粉代替超微粉,以次充好,給養(yǎng)殖業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟損失。

本課題擬在充分調(diào)研的基礎(chǔ)上,以白頭翁散為例,對其超微粉碎的最佳粒徑做系統(tǒng)的研究,力求制定出能夠很好控制超微粉質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。把超微粉碎在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用向前推進一大步。

1 材料與試劑

1.1 藥材 白頭翁、黃連、黃柏、秦皮,購自河南中醫(yī)學(xué)院一附院,經(jīng)鑒定,白頭翁是毛茛科植物白頭翁(Pulsatillachinensis(Bge.)Regel)的干燥根;黃連是毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch)的干燥根莖;黃柏是蕓香科植物黃皮樹(PhellodendronchinenseSchneid)的干燥樹皮;秦皮是木犀科植物苦櫪白蠟樹(FraxinusrhynchophyllaHance)的干燥干皮;粉碎后分別制成過60目篩、200目篩、300目篩、400目篩、500目篩的細(xì)粉。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品 鹽酸小檗堿(含量：86.8%,批號：110713-200208,中國藥品生物制品檢定所);

1.3 儀器 4O0 g搖擺式高速萬能粉碎機(型號OFY一400,溫嶺市林大機械有限公司);依利特高效液相(大連依利特公司);藥物溶出儀RCZ-8B(天津大學(xué)精密儀器廠);BS-210S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.4 試劑 甲醇(色譜純,鄭州派尼化學(xué)試劑廠);乙腈(色譜純,鄭州派尼化學(xué)試劑廠);H3PO4和十二烷基磺酸鈉(分析純,鄭州派尼化學(xué)試劑廠);鹽酸(煙臺市雙雙化工有限公司);三氯甲烷(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞破壁率的測定

2.1.1 細(xì)胞計數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及最佳濃度選擇精密稱取0.0152,0.2108,0.3145,0.5256,0.6332,0.7288 g細(xì)粉,分別置于25 mL容量瓶中,加水合氯醛約20 mL,超聲處理5 min,使粉末分散均勻,用水合氯醛定容至刻度。精密吸取藥液30 μL,裝片(裝片時,使混懸液布滿整個玻片,不溢出,無氣泡為度),置Wirnier 99顯微圖像分析儀(40×)下觀察。從白頭翁散粉末顯微特征分析(見圖1、2),考察白頭翁散微粉的細(xì)胞破壁率,宜選擇其木栓細(xì)胞破壁率的測定。

圖1 60目白頭翁散顯微特征 (4×10)

因此,以白頭翁散細(xì)粉中完整的木栓細(xì)胞為顯微特征計數(shù)物指標(biāo),其多為網(wǎng)狀或蜂窩狀,此特征具有代表性,進行計數(shù)(一個視野為1個計數(shù)單位,每個濃度的藥液取8個計數(shù)單位的平均值)

以白頭翁散粉末稱樣量為橫坐標(biāo),每個視野中完整的木栓細(xì)胞平均數(shù)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=30.867X+0.967 5,R2=0.978 8,說明白頭翁散細(xì)粉中完整木栓細(xì)胞在0.105 2-0.728 8 g范圍內(nèi)線性良好,可作為顯微特征計數(shù)。

2.1.2 白頭翁散超微粉細(xì)胞破壁率的檢測 分別稱取白頭翁散60目、200目、300目、400目、500目粉,精密稱定,按2.1.1所述方法制片,于顯微鏡下觀察。分別觀察25個視野,根據(jù)兩者完整木栓細(xì)胞個數(shù)、混懸液體積、稱樣量,計算白頭翁散不同粒徑下的顯微特征個數(shù)

白頭翁散粉末顯微特征個數(shù)/mg=XV/V′W

X為每個蓋玻片下的特征數(shù),V′為飲片混懸液總體積(mL);V為蓋玻片下混懸液體積(mL);W為飲片稱取量(mg)。

再根據(jù)白頭翁散細(xì)粉和超微粉的顯微特征個數(shù),計算細(xì)胞破壁率。破壁率Y=(A-B)/A×100%。Y為細(xì)胞破壁率,A為60目白頭翁散顯微特征個數(shù),B分別為白頭翁散200目、300目、400目、500目的顯微特征個數(shù)。

通過以上公式,計算得出白頭翁散200目、300目、400目、500目粒徑的細(xì)胞破壁率 Y分別為38.64% 、91.94% 、94.99% 、96.95% 。

2.2 小檗堿溶出度的測定 色譜條件：流動相：乙腈：0.05 moL/L磷酸二氫鉀溶液(45∶55)(每100毫升加十二烷基磺酸鈉0.1 g,磷酸調(diào)pH值4.0);色譜柱：依利特 C18柱;檢測波長：345 nm;流速：1 mL/min。

表2 白頭翁散粉末顯微特征(木栓細(xì)胞)個數(shù)計算的相關(guān)參數(shù) (n=25)

采用槳狀攪拌器法,溶出介質(zhì)900 mL 0.1 mol/L稀鹽酸,置于溶出杯內(nèi),加溫待溶出介質(zhì)溫度恒定在37℃(±0.5℃)后,轉(zhuǎn)速為100 r/min,各個粉碎目數(shù)樣品采樣5 g精密稱定,自供試品接觸溶出介質(zhì)起立即計時采樣。 (2、5、10、20、30、45、60 min)各采樣1.5 mL溶出液,立即用濾膜過濾,蒸干,加甲醇10 mL溶解定容,濾過,取續(xù)濾液,進樣20 μL,測峰面積。 結(jié)果見表2,圖3、4、5。

圖3 小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品

圖4 白頭翁散樣品

白頭翁散中小檗堿的提取試驗結(jié)果表明：從60目到500目小檗堿的溶出量(見表3)分別是30.1%、45.5%、82.4%、83.5%、85.9%。 說明由60目到500目,在相同的提取條件下小檗堿的溶出量明顯增多,300目和80目、200目相比,小檗堿的溶出均有極顯著差異(P＜0.01),但300目和400目、500目相比,小檗堿的溶出量雖有一定的差別,但沒有顯著差異(P＞0.05)。由表2可以看出,60目和200目的白頭翁散中小檗堿的溶出比較緩慢,都是到60 min時溶出量才達(dá)到最大。而300目、400目、500目的白頭翁散中小檗堿在30 min時就已經(jīng)達(dá)到最大了,雖然隨著時間的再延長會略有增加,但差異不顯著。并且,300目、400目、500目中小檗堿的溶出速度非?？?5 min時300目、400目、500目的溶出量分別是45.6%、50.1%、53.1%,比60目和200目的白頭翁散在60 min時的溶出最大量都多,有著極顯著的差異(P＜0.01)

圖5 白頭翁散超微粉小檗堿陰性

表3 不同粒徑白頭翁散中小檗堿的溶出度

3 討論

3.1 關(guān)于白頭翁散不同粒徑細(xì)胞破壁率的測定一般認(rèn)為,超微粉中藥的顆粒粒徑應(yīng)在l～75 μm范圍內(nèi),大多數(shù)超微粉中藥平均粒徑≤15 μm。在《中國獸藥典)2015版II部中,對粉末的分級,最細(xì)只分到200目(75 μm),并未涉及超微粉( ＜75 μm)粒徑的分等及限度[3]。其實在中藥領(lǐng)域的超微粉碎,最終的目的是把細(xì)胞壁打破[4],以利于有效成分的溶出。因此,破壁率的測定是中藥超微粉碎技術(shù)的所以白頭翁散經(jīng)過超微粉碎后,找出粒徑和細(xì)胞破壁之間的關(guān)系,確定最佳的粉碎粒徑,就可以確定白頭翁散超微粉的粒徑在什么范圍,為控制白頭翁散超微粉的質(zhì)量提供量化標(biāo)準(zhǔn)。。白頭翁散顯微特征包括石細(xì)胞、短纖維、導(dǎo)管、木栓細(xì)胞,通過對白頭翁散普通粉末及超微粉顯微特征的分析,其中木栓細(xì)胞呈網(wǎng)狀或者蜂窩狀,結(jié)構(gòu)典型,適宜作為檢測指標(biāo)進行破壁率的測定。試驗結(jié)果表明,白頭翁散300目的細(xì)胞破壁率已達(dá)到百分之九十以上,可以作為白頭翁散超微粉的制備工藝標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 關(guān)于不同粒徑白頭翁散小檗堿溶出度的考察

通常認(rèn)為,當(dāng)藥物溶出速率成為藥物吸收的限制步驟時,藥物的生物利用度與藥物成分的溶出量和溶出速率在一定程度上具有相關(guān)性,通過適當(dāng)?shù)墓に嚫淖兯幬锏娜艹鏊俾示涂梢蕴岣呱锢枚取Ｅ懦渌蛩氐挠绊?從理論上講,藥物的溶出速率主要取決于與溶劑液體接觸的顆粒表面積的大小,而表面積與顆粒粒度成反比,所以,藥物的粒度越細(xì),其溶出量和溶出速率也應(yīng)該越快。而300目的白頭翁散中小檗堿的溶出總量和溶出速率明顯高于200目,但和400目、500目的白頭翁散相比,雖然隨著時間的再延長會略有增加,但差異不顯著。

通過以上試驗,我們確定白頭翁散粉碎到300目時細(xì)胞破壁率已經(jīng)基本能達(dá)到90%以上,且小檗堿的溶出基本能夠達(dá)到理想的水平。而如果再繼續(xù)粉碎到400目、500目,其消耗會大大增加,但實際意義不大,因此我們確定白頭翁散超微粉的最佳粉碎粒徑為300目。

將中藥進行超微粉碎后,使有效成分得到了充分利用,豐富了中藥的劑型,提高了療效,和普通散劑相比,大大降低了用藥劑量,節(jié)約了藥材,保護了生態(tài)環(huán)境,應(yīng)用于禽病的防治即可混飼,又可混飲,使用方便。如果能在臨床上推廣應(yīng)用,必將帶來巨大的經(jīng)濟效益和社會效益,為畜牧業(yè)的健康發(fā)展作出實質(zhì)貢獻。