周冰心,傅 勇,劉 群,劉 晶

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 國家動物寄生原蟲實驗室農(nóng)業(yè)部動物流行病學(xué)重點(diǎn)實驗室,北京 海淀 100193)

頂復(fù)門原蟲是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,包括弓形蟲(Toxoplasma gondii)、隱孢子蟲(Cryptosporidium spp.)、瘧原蟲(Plasmodium spp.)等,是人和動物的重要病原。這些頂復(fù)門原蟲不僅能利用宿主細(xì)胞的脂肪酸,同時自身也存在脂肪酸代謝1]。盡管頂復(fù)門原蟲的脂肪酸代謝途徑在不同種屬之間存在很大差異[2],如惡性瘧原蟲存在Ⅱ型脂肪酸代謝途徑,隱孢子蟲存在Ⅰ型脂肪酸合成途徑,弓形蟲同時存在兩種途徑[3],但游離的脂肪酸只有被CoA或酰基載體蛋白硫脂化形成脂酰CoA之后才能夠參與細(xì)胞內(nèi)的各種代謝途徑。

脂酰CoA需要載體蛋白協(xié)助才能轉(zhuǎn)運(yùn)到各靶位點(diǎn)發(fā)揮作用。生物體內(nèi)的脂肪酸載體蛋白主要有3種,分別為脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Fatty acid transport proteins,FATPs)、脂肪酸結(jié)合蛋白(Fatty acid binding proteins,FABPs)和?；鵆oA結(jié)合蛋白(Acyl coenzyme A-binding proteins,ACBPs)。其中ACBPs是一類保守性極強(qiáng)的家族蛋白,又稱為安定結(jié)合抑制劑或地西泮結(jié)合抑制劑,廣泛存在于真核生物中[4]。目前關(guān)于ACBP在植物、哺乳動物中的結(jié)構(gòu)與功能研究相對深入,但對真核生物中頂復(fù)門原蟲的ACBP研究鮮有文獻(xiàn)報道,本研究以隱孢子蟲已公布的ACBP為模板[5-6],從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到一些具有代表性的頂復(fù)門原蟲的ACBPs氨基酸序列,包括隱孢子蟲、新孢子蟲、弓形蟲、瘧原蟲、巴貝斯蟲、艾美耳球蟲,并利用 ToxoDB、CryptoDB、PlasmoDB等專屬數(shù)據(jù)庫對預(yù)測的部分蟲種ACBPs進(jìn)行核實。利用生物信息學(xué)軟件對這些蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對分析,對其理化性質(zhì)、進(jìn)化情況、蛋白結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測,歸納其異同點(diǎn),為頂復(fù)門原蟲脂肪酸代謝研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 頂復(fù)門原蟲ACBPs序列來源及比對數(shù)據(jù)庫NCBI 數(shù) 據(jù) 庫 (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/);ToxoDB 數(shù)據(jù)庫(http：//toxodb.org/toxo/);CryptoDB 數(shù)據(jù)庫(http：//cryptodb.org/cryptodb/);PlasmoDB 數(shù)據(jù)庫(http：//plasmodb.org/plasmo/)。

1.2 理化性質(zhì)分析 運(yùn)用在線工具ExPASy-ProtParam(https：//web.expasy.org/protparam/)分析頂復(fù)門原蟲ACBPs的相對分子量、氨基酸組成、等電點(diǎn)、親水性等理化性質(zhì)。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析 應(yīng)用DNAMAN(V6)軟件對頂復(fù)門原蟲ACBPs氨基酸殘基進(jìn)行比對分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 保守性結(jié)構(gòu)域分析 運(yùn)用在線工具SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)分析頂復(fù)門原蟲ACBPs蛋白的保守性結(jié)構(gòu)域,并使用IBS 1.0軟件繪制頂復(fù)門原蟲ACBPs的保守性結(jié)構(gòu)域圖。

1.5 二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 運(yùn)用在線軟件Predict-Protein(https：//www.predictprotein.org)對頂復(fù)門原蟲ACBPs的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測;運(yùn)用在線軟件SWISS-MODEL(https：//www.swissmodel.expasy.org)將頂復(fù)門原蟲ACBPs同源建模進(jìn)而預(yù)測三級結(jié)構(gòu),同時使用在線工具 RAMPAGE(http：//mordred.bioc.cam.ac.uk/～rapper/rampage.php)對預(yù)測到的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗證。

1.6 亞細(xì)胞定位和功能預(yù)測 運(yùn)用在線工具M(jìn)ultiLoc2(http：//abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/MultiLoc2)以及 TargetP 1.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)對頂復(fù)門原蟲ACBPs的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂復(fù)門原蟲ACBPs理化性質(zhì)分析 通過比對隱孢子蟲的ACBP序列發(fā)現(xiàn),隱孢子蟲與新孢子蟲均只有一個ACBP,弓形蟲、巴貝斯蟲、艾美耳球蟲各有2個ACBP,瘧原蟲有4個ACBP(表1)。ACBPs按照蛋白質(zhì)分子量大小可分為兩大類：Ⅰ型分子量較小,約為10 kDa左右,如NcACBP1,PfACBP1,TgACBP1,EtACBP1等;Ⅱ型ACBPs分子量較大,約為30 kDa左右,如TgACBP2,BbACBP2等。

蛋白質(zhì)的親水性與其氨基酸的極性有關(guān),等電點(diǎn)主要取決于其氨基酸所帶的電荷性質(zhì),同時也與該蛋白的大小及其亞細(xì)胞定位相關(guān)[7]。對頂復(fù)門原蟲ACBPs氨基酸序列的親水性和等電點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn),其絕大多數(shù)氨基酸為疏水性,故所有ACBPs的親水性質(zhì)均為負(fù)值,且親水性大小依次為 Ⅰ型＜Ⅱ型。頂復(fù)門原蟲 ACBPs的等電點(diǎn)相差較大,CpACBP帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp+Glu,14.9%)大于帶正電荷的氨基酸(Lys+Arg,11.2%),其等電點(diǎn)最低;而PfACBP4(Asp+Glu,11.30%)小于(Lys+Arg,14.00%),其等電點(diǎn)最高。

表1 幾種頂復(fù)門原蟲?；o酶A結(jié)合蛋白(ACBP)的理化參數(shù)

2.2 頂復(fù)門原蟲ACBPs的系統(tǒng)進(jìn)化分析 同源性是指在進(jìn)化過程中源于同一祖先的分支之間的關(guān)系,對氨基酸序列的同源性進(jìn)行分析有助于推測各物種間的親緣關(guān)系。對頂復(fù)門原蟲ACBPs氨基酸殘基比對發(fā)現(xiàn),該蛋白在進(jìn)化過程中保守性非常強(qiáng),見封二彩版圖1中所示粉色標(biāo)注部分的幾種氨基酸殘基如 Tyr(Y)、Lys(K)、Cys(C)、Gly(G)、Val(V)、Ala(A)的相似性高達(dá)75%,均是構(gòu)成ACBD所需的保守性氨基酸殘基。而且大部分氨基酸殘基的相似性可達(dá)33%。這些相似性極強(qiáng)的氨基酸殘基可能在ACBPs的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性、有效折疊以及與其配體結(jié)合或其他功能中起到重要作用。

系統(tǒng)發(fā)育樹可以描述不同生物之間的相關(guān)關(guān)系,并揭示生物的進(jìn)化歷史過程。NcACBP與TgACBP1以及TgACBP2與CpACBP在系統(tǒng)發(fā)育樹中均相距很近(圖2),說明兩者在物種進(jìn)化過程中親緣性非常高;此外,進(jìn)化樹分支的長短體現(xiàn)出此類蛋白質(zhì)在進(jìn)化過程中出現(xiàn)的先后順序,由此推斷出EtACBP1是在頂復(fù)門原蟲進(jìn)化過程中最早出現(xiàn),而PfACBP4則出現(xiàn)的最晚。雖然系統(tǒng)發(fā)育樹并不能揭示各頂復(fù)門原蟲ACBPs之間的聯(lián)系,但能夠說明這些蛋白參與了頂復(fù)門原蟲的進(jìn)化過程[4]。

圖2 頂復(fù)門原蟲ACBPs的氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 頂復(fù)門原蟲ACBPs的保守性結(jié)構(gòu)域 結(jié)構(gòu)域是生物大分子中具有特異結(jié)構(gòu)和獨(dú)立功能的區(qū)域,是蛋白質(zhì)生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。保守性結(jié)構(gòu)域是指在生物進(jìn)化或者一個蛋白家族中具有不變或相同的結(jié)構(gòu)域,對蛋白質(zhì)的保守性結(jié)構(gòu)域的研究有助于揭示其在生物進(jìn)化過程中的重要功能。對頂復(fù)門原蟲ACBPs的保守性結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),不同蟲體的ACBPs都至少含有1個ACBD,但在不同物種中該結(jié)構(gòu)所處的位置有所差異(圖3)。蛋白質(zhì)分子量越大,其結(jié)構(gòu)與功能也越復(fù)雜。Ⅰ型ACBPs僅含有1個ACBD,且位于3～89位氨基酸殘基處,說明其蛋白功能比較單一且特異;Ⅱ型ACBPs除了2個ACBD之外還包含2個ANK,位于其N-末端的第168～356位氨基酸殘基處,其中EtACBP2還含有1個跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane region,TMR),位于其10～32位氨基酸殘基處;PfACBP4有2個ANK(294-323、327-356)和 4 個 ACBD(63-71、118-155、158-183、253-260),故其分子量較大,可能影響其對酰基CoA的結(jié)合親和力和轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

圖3 頂復(fù)門原蟲ACBPs的保守性結(jié)構(gòu)域分析

2.4 頂復(fù)門原蟲ACBPs的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈借助氫鍵沿一維方向排列成具有周期性的結(jié)構(gòu)構(gòu)象,是多肽鏈局部的空間結(jié)構(gòu),主要構(gòu)成有α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲等幾種形式。頂復(fù)門原蟲ACBPs的二級結(jié)構(gòu)相對簡單,主要為α-螺旋(alpha-helix)和無規(guī)則卷曲(random coil)或稱為環(huán)(loop)。由于EtACBP2的保守性結(jié)構(gòu)域中不僅僅由1個ACBD組成,還分別含有1個TMR及2個ANK,BbACBP2也含有2個ANK結(jié)構(gòu),所以兩者在二級結(jié)構(gòu)上還包含有小部分延長鏈(extend strand)。除此之外,頂復(fù)門原蟲中其他ACBPs的二級結(jié)構(gòu)均由簡單的α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成。其中CpACBP的HELIX與LOOP各占一半(50%)。而且即使是同種寄生蟲的ACBP,其二級結(jié)構(gòu)也存在差異,一般而言分子量大的ACBP中LOOP的含量要高于HELIX;分子量較小的 ACBP中 LOOP的含量則低于 HELIX。如TgACBP1(95 kDa)中HELIX約占60%,而TgACBP2(311 kDa)中HELIX僅占45%左右。

從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析,蛋白質(zhì)分子的疏水內(nèi)核保守性比親水表面高,疏水結(jié)構(gòu)核心大部分由規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)單元,即α螺旋和β折疊構(gòu)成,其埋藏表面積較大。而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的親水表面則很少出現(xiàn)有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu),常見的是轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲,這部分結(jié)構(gòu)的埋藏表面積較小。因此,從其二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)成便可以解釋,為何這幾種頂復(fù)門原蟲ACBPs的親水性均為負(fù)值。

蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是指球狀蛋白質(zhì)的多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上相互配置而形成特定的構(gòu)象。根據(jù)預(yù)測結(jié)果,選定與模型蛋白比對覆蓋率最高(≥98%)的模型,可以發(fā)現(xiàn)ACBPs的三級結(jié)構(gòu)較為簡單：4個α螺旋束蛋白上下排列形成疏水性結(jié)合口袋,其間由殘基環(huán)與之相連(見封二彩版圖4)。ACBPs的配體結(jié)合位點(diǎn)理論上由三部分組成：一部分以鹽橋或氫鍵的方式與酰基CoA的3′-磷酸集團(tuán)結(jié)合并提供全部結(jié)合過程中40%的能耗,一部分以非極性分子作用力與腺嘌呤環(huán)相結(jié)合并保證其在極性溶劑中的穩(wěn)定性,另一部分結(jié)合配體的?；溡园l(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)功能[8]。雖然蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的微小變化僅導(dǎo)致其結(jié)合親和力和能量有所損失,但其結(jié)合能一旦發(fā)生微小改變,蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性將產(chǎn)生巨大變化。不同物種ACBPs的α螺旋處氨基酸殘基有所不同,使得形成的結(jié)合口袋的大小、以及針對不同配體的結(jié)合親和力存在差異,以適應(yīng)不同物種對不同脂肪酸的需求量差異,同時也說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上存在的微小差異,可能導(dǎo)致其主要的生物功能發(fā)生很大變化。ACBPs為疏水性蛋白質(zhì),二級結(jié)構(gòu)相對簡單,主要為α螺旋和無規(guī)則卷曲;其疏水性結(jié)合口袋末端氨基酸殘基的差異使其能夠與不同的配體特異性結(jié)合;其中,與?；鵆oA特異性結(jié)合的ACBD是其結(jié)構(gòu)中最重要的一部分,對三級結(jié)構(gòu)的分析將有助于闡明ACBP與其他分子相互作用的空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

2.5 頂復(fù)門原蟲ACBPs的亞細(xì)胞定位和功能預(yù)測 蛋白質(zhì)在核糖體合成后經(jīng)蛋白質(zhì)分選信號引導(dǎo)后被轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的細(xì)胞器中,部分蛋白質(zhì)則被分泌到細(xì)胞外或留在細(xì)胞質(zhì)中,只有轉(zhuǎn)運(yùn)到正確的部位才能參與細(xì)胞的各種生命活動,如果定位發(fā)生偏差,將會對細(xì)胞功能產(chǎn)生重大影響。此外,蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)常在不同的亞細(xì)胞環(huán)境中運(yùn)動而發(fā)揮作用,而非靜止不動的;而且成熟的蛋白質(zhì)必須在特定的細(xì)胞部位才能發(fā)揮其生物學(xué)功能。頂復(fù)門原蟲ACBPs的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn),TgACBP2、EtACBP2、PfACBP3均屬于分泌蛋白,其他蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)中。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以決定其功能以及發(fā)揮此功能的亞細(xì)胞定位。ACBD是ACBPs中最為核心的結(jié)構(gòu)域,而且ACBPs也是由于該結(jié)構(gòu)域能夠以高特異性和親和性結(jié)合酰基CoA而命名的[4],所有的ACBPs都是由同一個祖先演化而來的,只是在該過程的基因復(fù)制和重排中產(chǎn)生了差異,所以才進(jìn)化出了不同型的ACBPs[9]。ACBPs在細(xì)胞內(nèi)的定位取決于其與何種配體相結(jié)合[15],故對其亞細(xì)胞定位的預(yù)測發(fā)現(xiàn),ACBPs大部分定位于細(xì)胞質(zhì)中,少部分屬于分泌蛋白,這與其在生物體內(nèi)結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)酰基CoA的功能有關(guān)。同時,EtACBP2上的跨膜結(jié)構(gòu)域(TMR)可與信號肽重疊,既可將其自身錨定于細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)又可將其輸送至胞外環(huán)境中[10],故EtACBP2被預(yù)測為分泌蛋白的一種。另外,BbACBP2、TgACBP2與PfACBP4中的ANK可參與轉(zhuǎn)錄起始、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)以及細(xì)胞骨架完整性等多種基本生物學(xué)功能,并將不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)運(yùn)送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或質(zhì)膜等特定的區(qū)域[11],故BbACBP2、TgACBP2與PfACBP4等均定位于細(xì)胞質(zhì)中。

3 討論

ACBPs能夠高特異性、高親和力地結(jié)合不同長度的長鏈脂酰CoA(C14～C22);對短鏈和游離脂酰CoA的結(jié)合親和力低;不結(jié)合游離脂肪酸、棕櫚酰肉毒堿和類固醇等,在生物體內(nèi)作為?；鵆oA庫的前體并參與其轉(zhuǎn)運(yùn),發(fā)揮多種重要功能[9,12]。另外,ACBPs可以將質(zhì)體中合成的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,參與脂肪酸、甘油三酯等的生物合成與代謝活動[5]。釀酒酵母、惡性瘧原蟲以及人的ACBPs蛋白結(jié)構(gòu)非常相似[10],且該蛋白在哺乳動物中的肝臟、心臟、骨骼肌等許多組織器官中也有較高的表達(dá)水平[11],提示ACBPs可能參與許多重要的基本生物功能,在生物進(jìn)化過程中具有較高的保守性。本研究從生物信息學(xué)角度解析了幾種代表性的頂復(fù)門原蟲的ACBPs,也發(fā)現(xiàn)這類蛋白的保守性很強(qiáng)。早期研究認(rèn)為,小分子量的ACBP是唯一能夠以高親和力結(jié)合?；鵆oA的蛋白,但近年來的研究發(fā)現(xiàn),植物和動物中存在分子量更大的ACBPs(50～80 kDa)[13-14],大分子量的ACBPs不僅僅局限于一個ACBD,有的還包含ANK以及TMR等結(jié)構(gòu),蛋白結(jié)構(gòu)越復(fù)雜提示其功能越多樣化。本實驗室目前已經(jīng)驗證弓形蟲中存在2個ACBPs,其中TgACBP1僅含有95個氨基酸殘基(～10 kDa),TgACBP2含有311個氨基酸殘基(～34 kDa),雖然兩者分子量大小存在差異但均具有結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)?；鵆oA的功能。

新興的基因編輯技術(shù)為研究ACBPs的功能提供了極大的便利。運(yùn)用siRNA調(diào)控干擾ACBP基因在人肝癌細(xì)胞HepG2中的表達(dá),可導(dǎo)致飽和(16∶0)及單不飽和(16∶1,18∶1)的脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)的含量顯著減少,并嚴(yán)重影響脂肪酸的新陳代謝活動15]。酵母和小鼠ACBPs基因缺失后,也表現(xiàn)出長鏈脂肪酸和神經(jīng)酰胺的合成受損,表明ACBPs可能特異性的影響長鏈脂酰輔酶A代謝酶的活動[14]。

頂質(zhì)體是頂復(fù)門原蟲特有的細(xì)胞器,參與頂復(fù)門原蟲脂肪酸、血紅素等的新陳代謝過程[16]。在頂質(zhì)體內(nèi)進(jìn)行的各類新陳代謝過程中,脂肪酸是蟲體重要的能量來源,其中ACBPs在脂肪酸代謝中起著關(guān)鍵性作用。頂復(fù)門原蟲中的弓形蟲和新孢子蟲等胞內(nèi)寄生原蟲能感染多種動物,同時作為機(jī)會性致病原蟲,不僅藥物治療效果不顯著而且還容易產(chǎn)生耐藥性,給人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大威脅。從生物信息學(xué)入手找到它們的ACBPs,分析這些ACBPs的進(jìn)化關(guān)系、保守性結(jié)構(gòu)域、蛋白結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能不僅能夠為研究頂復(fù)門原蟲脂肪酸代謝提供背景資料,還有可能為研發(fā)治療頂復(fù)門原蟲病的藥物提供理論依據(jù)。